第四章 核酸电泳VIP免费

核酸物质提取与电泳天然DNA的制备一般地说。总DNA主要是指基因组DNA(genomicDNA)，即细胞核内的染色体DNA分子。核DNA分子呈极不对称的线状结构．一条染色体为一个DNA分子。高等植物核DNA大约含有106bp,其长度与直径的比例极不对称．使其对机械力十分敏感。虽然目前可以成功地测定出它的一级结构。但仍难以分离出它的完整分子。1.天然DNA的来源(1)染色体DNA(2)病毒与噬菌体(3)质粒DNA(4)线粒体与叶绿体2.DNA的提取细胞的破碎破碎的手段：物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法:容易导致DNA链的断裂.对于细胞破碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。超生波液氮总DNA的提取方法：去除多糖、脂类、蛋白等，得到的就是核酸去除多糖：CTAB、PVP、高盐溶液等去除脂类：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶Ｋ、酚／氯仿等DNARNA质粒DNA的提取破坏细胞壁溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜十二烷基磺酸钠(SDS)、TritonX-100蛋白质及其它杂质的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出来高浓度盐离子(KCl)使变性蛋白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来细菌线形染色体DNA的去除强热、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性，当快速降温、加入酸中和时，已变性的细菌线性染色体DNA变性不能快速复性，与其它杂质缠绕而沉淀出来质粒DNA双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。3.DNA的浓缩(1)乙醇(2)异丙醇(3)聚乙二醇(PEG600)工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好RNA的提取分离RNARNA提取的通用方法提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法原理：•细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；•释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；•有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。异硫氰酸胍/苯酚法步骤:•材料准备：尽量新鲜。•裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。•纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。•洗涤：70％乙醇。•沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。RNA提取的通用方法影响影响RNARNA提取的因素提取的因素材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存影响影响RNARNA提取的因素提取的因素样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：•培养细胞：通常可直接加裂解液裂解•酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁•动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素RNA提取常见问题RNA的降解OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。OD260/OD280比值偏低蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次...