蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析VIP免费

双向电泳操作经验及解析蛋白质组研究概述1双向电泳样品制备2双向电泳操作解析3荧光差异双向电泳4目录染色及差异分析5蛋白质组研究概述1双向电泳样品制备2双向电泳操作解析3荧光差异双向电泳4目录染色及差异分析5蛋白质组学研究必要性�生物调控机制的复杂性：涉及多个基因的多个层次的系统调节�蛋白质：基因功能的执行者，调控更为直接�蛋白质组学：从全局和整体的角度发现去解决问题，分析更为全面�蛋白质组学与代谢组学等其它策略相结合：发展的新趋势FromDNAtoProteinFromProteintoMetabolite数据库：NCBI-PUBMED时间：2011年9月5日条件：标题检索词汇：物种名+proteome蛋白质组学研究现状�表达蛋白质组学：�人类肝脏蛋白质组计划�人类血浆蛋白质组计划�比较蛋白质组学：�动物疾病的发病机制�植物抗逆的分子机理�生物标志物发掘�蛋白质互作组学�蛋白质翻译后修饰蛋白质组学主要研究方向凝胶非凝胶双向凝胶电泳(2-DE)荧光差异双向电泳(DIGE)二维色谱(2D-HPLC)毛细管电泳(HPCE)分离一级质谱(MS-PMF)串联质谱(MS/MS)部分序列比对(SequenceQuery)鉴定计算机辅助（PDquest、Mascot）蛋白质组学研究常用技术�优点：蛋白质组研究的经典技术、分辨率高、可视性好�缺点：重复性不高、对于极端等电点和极端分子量蛋白分离效果不好蛋白质双向凝胶电泳部分仪器设备等电聚焦仪SDS-PAGE电泳仪凝胶扫描仪蛋白质双向凝胶电泳CBBStainpH4712%SDS-PAGE蛋白质双向凝胶电泳SilverStain常规双向电泳荧光差异双向电泳蛋白质双向凝胶电泳蛋白质组研究概述1双向电泳样品制备2双向电泳操作解析3荧光差异双向电泳4目录染色及差异分析5生物样品分类真菌细菌植物动物其它生物分类体液亚细胞细胞组织其它形态分类高低次生代谢物低高蛋白含量有无液泡有无细胞壁植物组织动物组织特性�细胞壁：增强细胞坚韧程度，同时也增加细胞破碎难度�液泡：含有多糖多酚类物质，干扰蛋白提取�蛋白含量：需要的样本量与样本蛋白含量高低密切相关，同时蛋白含量较低的植物样品往往需要通过一些方法进行蛋白富集�次生代谢物：植物组织次生代谢物质含量高，一方面降低蛋白含量、另外也可能干扰蛋白提取以动植物组织为例：生物样品分类�高溶解能力：尽可能提取出最大量的蛋白，减少蛋白损失�去杂：多糖、DNA、蜡质、多酚、油脂�高浓度：蛋白沉淀、冻干、超滤进行浓缩�去高丰度蛋白：白蛋白、IgG、Rubisco�避免蛋白损失和人为修饰：减少操作步骤、含尿素溶液温度不要超过37度�避免降解：减少操作步骤、低温操作、添加蛋白酶抑制剂样品制备要求�机械方法：�液氮研磨：细菌、动植物组织�高速匀浆：细菌、动植物组织�物理方法：�超声处理：细菌、脑组织匀浆、培养的动物细胞�反复冻融：培养的动物细胞�冷热交替：培养的动物细胞�化学方法：�裂解液裂解：培养的动物细胞�酶溶解：细菌、酵母样品破碎方法常用制备方法直接裂解法：�优点：操作简单，速度快、蛋白得率高�缺点：杂质多�适用样品：动物组织或细胞TCA/丙酮沉淀法：�优点：蛋白纯度高�缺点：操作繁琐、速度慢，蛋白损失多�适用样品：植物组织、体液、胞外分泌蛋白常用制备方法超滤法：�优点：操作简单，速度快�缺点：费用贵�适用样品：胞外分泌蛋白、体液、尿液其它方法：�硫酸铵沉淀法�酚抽提法�酒精提取法�……蛋白裂解液配置蛋白裂解液成分：�变性剂：尿素、硫脲�去污剂：两性去污剂(CHAPS)、非离子去污剂(NP-40、Triton-100)、阴离子去污剂(SDS)�还原剂：DTT、DTE、TBP、2-巯基乙醇�增溶剂：两性电解质、Tris碱常用裂解液：�Tris裂解液：40mMTris(pH=9.5)�尿素裂解液：9M尿素、4%CHAPS、1%DTT、1%CA�尿素硫脲裂解液：7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、1%DTT、1%CA常用样品保存方法及保存时间一次一次多次反复使用次数数年数年1个月保存时间冻干成蛋白干粉后冷冻保存冷冻保存于-20度、-80度或液氮条件4度保存于蛋白溶液特性蛋白提取常见问题实例Buffer：7M尿素、2M硫脲、4%CHAPS、1%DTT、1%IPGbuffer症状：靠近酸性端形成纵向分割，形成“半面妆”可能原因：硫脲使烷基化不完全改进：裂解液中不添加硫脲Buffer：9M尿素、4%...