第三讲环境生物技术研究方法环境生物技术Environmentalbiotechnology(一)第一节传统微生物分析方法第一节传统微生物分析方法主要内容主要内容第二节现代微生物分析方法第二节现代微生物分析方法第一节传统微生物分析方法第一节传统微生物分析方法一.显微直接计数法一.显微直接计数法利用血球计数板在显微镜下直接测定。观察一定容积中微生物个体数目，然后推算出含菌数（包括死活细胞、微小杂物）。结果往往偏高。常用于形态个体较大的菌体或孢子1mm1mm二.平板计数法二.平板计数法目的想知道待检测样品中的微生物数量原理根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。菌落总数：指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的微生物菌落总数。菌落总数并不表示实际中的所有微生物总数，菌落总数并不能区分其中微生物的种类，所以有时被称为杂菌数。操作程序首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经过培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。•平板倾注法先把适量稀释液(1mL)移进灭菌培养品，再倒入已融化并冷却至45～50℃的培养基，轻轻转动平板，使稀释液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，适温培养。•平板表面涂布法先将融化的培养基凝固，再移入适量稀释液（0.2mL），然后用涂布刀涂布于整个平板的表面，放置片刻(约l0min)，将平板翻转,适温培养。操作方法•平板表面点滴法与涂布法相似，用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0．025mL)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在平板背面用标记笔划成四个区域)，每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平片刻(约5～10min)，然后翻转平板，适温培养。主要工具细菌:牛肉膏蛋白胨培养基细菌:牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏：3g水：1000ml蛋白胨：5g琼脂：18gpH：7.0-7.2牛肉膏：3g水：1000ml蛋白胨：5g琼脂：18gpH：7.0-7.2放线菌:改良高氏1号培养基放线菌:改良高氏1号培养基KNO3：1.0g水：1000mlK2HPO4：0.5g淀粉：20gMgSO4·7H2O：0.5gNaCl：0.5gFeSO4·7H2O：0.5g琼脂：18gKNO3：1.0g水：1000mlK2HPO4：0.5g淀粉：20gMgSO4·7H2O：0.5gNaCl：0.5gFeSO4·7H2O：0.5g琼脂：18g真菌:马丁培养基真菌:马丁培养基KH2PO4：1.0g葡萄糖：10gMgSO4·7H2O：0.5gNaCl：0.5g琼脂：18g水：1000mlKH2PO4：1.0g葡萄糖：10gMgSO4·7H2O：0.5gNaCl：0.5g琼脂：18g水：1000ml3.3ml1%孟加拉红/1000ml0.3ml1%链霉素/100ml通常情况下的稀释度细菌：10-4~10-6真菌：10-1~10-3放线菌：10-3~10-5通常情况下的稀释度细菌：10-4~10-6真菌：10-1~10-3放线菌：10-3~10-5培养：28~30℃细菌：3~5d真菌：5~7d放线菌：10~14d培养：28~30℃细菌：3~5d真菌：5~7d放线菌：10~14d2~3d3~5d5~7d20~20010-10020-200注意事项（1）样品稀释时尽量使样品中的微生物细胞分散开，以单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞）（2）接种量要准确（3）涂布要均匀使用范围一般用于土壤、水源、大气、食品等的污染程度检验三.最大或然数法（MPN）三.最大或然数法（MPN）目的计数待测样品中的特殊功能微生物数量；检测样品中特殊微生物功能是否存在最大或然数(mostprobablenumber，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。原理将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lmL）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值.操作程序10-210-310-410-510-61ml9...
