gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗的实验研究gP96多肽复合物／树突状细胞疫苗的实验研究北京大学人民医院胸部微创中心胸外科博士研究生：李运导师：王俊教授研究背景全世界肺癌病例1910年<200例1912年374例1920年956例（美国）新增肺癌病例肺癌死亡病例1997年178，100160，4002002年169，400154，9002003年171，900157，200发病占全部肿瘤发生的15%，死亡占全部因肿瘤死亡病例的29%整体疗效与30年前比较没有明显提高，总的五年生存率仍不足15%肿瘤抗原免疫系统特异性抗原识别破坏和消灭肿瘤细胞抗原呈递系统HSPs具有结合细胞内抗原性多肽的能力，可以带有肿瘤细胞内全部抗原肽----具有该细胞特有的抗原库的作用,称为“分子伴侣”抗原gP96经典的外源性抗原呈递途径gP96介导的外源性抗原呈递途径通过MHC-II类分子激活CD4+T淋巴细胞通过MHC-I类分子激活CD8+T淋巴细胞途径激发人体有效的特异性抗肿瘤免疫功能树突状细胞----体内最强的抗原呈递细胞+>>gP96orDC科研工作新问题单方面要素两方面要素gP96多价性特异性（抗原库）DC识别抗原激活细胞免疫（专职抗原呈递细胞）研究内容肺癌组织提取gP96SDS—PAGE凝胶电泳、银染鉴定、Western印迹分析蛋白定量分析RT-PCR检测RNA水平表达免疫组化检测蛋白水平表达第一部分gp96多肽复合物提取鉴定在肺癌组织中表达的研究肺癌组织gP96提取和鉴定；肺癌组织和正常组织gP96的表达水平；[目的][流程]00.020.040.060.080.10.1200.050.10.150.20.250.3BSA浓度（mg/ml）OD值定量分析测得所提取的gp96蛋白浓度在0.1µg/ul左右，相当于50-80ug/g组织。肺癌组织细胞浆中有棕黄色颗粒聚集正常肺组织中细胞苏木素染色阴性同一患者标本GeneN(x±s)T(x±s)tvaluepvaluegp960.6725±0.47131.110±0.4467-4.318<0.001外周血单个核细胞提取及体外扩增流式细胞仪鉴定gP96与树突状细胞共孵育制备疫苗体外CTL反应，INF-γ浓度淋巴细胞表型分析第二部分gP96多肽复合物/DC疫苗体外诱导CTL反应实验研究外周血来源DC培养和鉴定gP96多肽复合物/DC疫苗的制备gP96/DC体外实验[目的][流程]培养2-3天后的DC培养7天后的DCA-1．培养前CD1a-A-2.培养后CD1a+B-1.培养前CD86-B-2.培养后CD86+C-1.培养前CD83-C-2.培养后CD83+D-1.培养前CD80-D-2.培养后CD80+E-1.培养前CD14+E-2.培养后CD14-CD14-；CD80+；CD83+；CD86+培养前淋巴细胞的CD3培养10d后淋巴细胞的CD3培养前淋巴细胞的CD4、CD8培养10d淋巴细胞的CD4、CD8CD3/CD8＋T细胞明显增加；CD8＋/CD4＋细胞比例增加00.10.20.30.40.50.60.70.80.91020040060080010001200Concentration(pg/ml)OD样本ELISA反应的OD值(X±S)释放IFN-γ的量（pg/ml）gp96/DC2.244±0.1334150.835gp961.674±0.1623066.847DC0.126±0.011122.966建立动物模型以制备的疫苗免疫动物并种植肿瘤观察成瘤率，肿瘤体积，动物生存时间第三部分gP96多肽复合物/DC疫苗动物体内实验研究gP96/DC在小鼠体内的抑制肿瘤生长作用的研究[目的][流程]LA795肺癌肿瘤组织提取Gp96小鼠外周血615小鼠肺癌模型Gp96/DC，Gp96，DC提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响SCID小鼠PAa肺癌肿瘤组织提取Gp96人外周血免疫重建小鼠荷人肺癌免疫重建小鼠Gp96/DC疫苗提取DC细胞观察肿瘤生长情况及对小鼠生存期的影响615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积020004000600080001000012000种植一周二周三周四周五周六周肿瘤种植时间肿瘤体积（mm³）615小鼠未免疫组615小鼠DC免疫组615小鼠GP96免疫组615小鼠GP96+DC免疫组100%75%615小鼠肿瘤植入后不同时间的肿瘤体积（x±scm³）组数处理动物数肿瘤植入后天数212835Ⅰ种植102.63±0.876.46±1.478.04±1.40ⅡGP9680.33±0.27※0.70±0.62※1.49±1.17※ⅢDC80.30±0.22※0.64±0.49※1.16±0.92※ⅣGP96+DC80.21±0.22※△0.32±0.30※△0.62±0.30※△615---LA795※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和Ⅲ组比较，P<0.05615小鼠肿瘤植入后的生存时间组数处理动物数肿瘤植入后生存天数Ⅰ种植1052ⅡGP96851.5ⅢDC858.5※ⅣGP96+DC877※△SCID---PAa※：与Ⅰ组比较，P<0.05。△：与Ⅱ组和...
