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SNP及突变研究的最新工具高分辨率熔解曲线（HighResolutionMelting）突变筛查和基因分型系统北京思博全科技有限公司内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）•高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器HighResolutionDNAMelting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：PCRTube1Tube2Tube3WildtypeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突变检测原理Lightscanner高分辨溶解曲线结果SaturatingdyeLCGreenplus——高分辨溶解曲线专用荧光染料内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器MutationScanningMutationScanning未知SNP扫描M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。BernhardJ.HoWnger·Hai-ChunJing·KimE.Hammond-Kosack·KostyaKanyuka(BarleyApplication)TheorApplGenet(2009)119:851–865DOI10.1007/s00122-009-1094-2数据来自英国洛桑农业实验站Bernhard等对Barley的eukaryotictranslationinitiationfactor4E(eIF4E)gene基因外显子进行突变扫描结果内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器SmallAmpliconGenotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定•使用已知Tm值的双链DNA做温度内标，低温内标Tm(~61℃),高温内标Tm(~92℃)•内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正。•PCR片段的Tm值范围：70-88℃•优点：不需要探针，直接利用PCR产物针对已知突变位点进行基因分型为何要使用温度内标A>TSNPA>TSNPwithoutwithoutCalibration–72bpCalibration–72bpApplyTemperatureCalibrationApplyTemperatureCalibrationA>TSNPA>TSNPwithwithCalibrationCalibrationSmallAmpliconGenotypingSmallAmpliconGenotypingM.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT。内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—非标记探针法（UnlabeledProbeGenotyping，LunaProbe）—SSR分析—检测甲基化•HRM仪器HRM–LunaprobegenotypingHRM–LunaprobegenotypingHRM–HRM–LunaprobeLunaprobegenotypinggenotyping1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs1Probe–1SNP,AllPossibleSNPs1Probe–1SNP,AllPossibleSNPsClass1C:T,G:AClass2C:A,G:TClass3C:GClass4A:T1Probe,2SNPs,1Amplicon1Probe,2SNPs,1Amplicon2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE2Probes,2SNPs,1Amplicon-ApoE2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFE2Probes,2SNPs,2Amplicons-HFEAmpliconScanning–AmpliconScanning–发现新的突变发现新的突变DavidDe，YongSongatel.Applicationoghigh-resolutionDNAmeltingforgenotypingandvariantscanningofdiploidandautotetraploidpotatoMolBreeding(2010)25:67–90rrRRRrMixRr:rrby1:1RrrrMixRR:Rrby1:1RRRr内容提示•高分辨熔解曲线（HighResolutionMelting）的定义•高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用—筛查突变（mutationscanning）—基因分型（MutationGenotyping）—小片段+内标法（SmallAmpliconGenotyping）—...