透射电镜样本的制备超薄切片制样负染超薄切片由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。1957年，英国Huxley发明超薄切片机。超薄切片制片过程取材取材具体方法将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的蜡片上。将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新鲜固定液，然后置于4℃冰箱内固定。固定目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的侵入繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后的冲洗和脱水时溶解和流失。固定方法化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定灌注固定通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结构。适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的固定。理想固定剂常用固定剂固定方法——戊二醛-锇酸双固定先用2.5%戊二醛固定2h以上。缓冲液多次清洗（pH7.40.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，15min/次）。1%锇酸固定2h。清洗组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。锇酸可与乙醇作用生成沉淀。清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲液）脱水去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备常用脱水剂乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为中间溶剂进行转换。丙酮市售的无水丙酮含少量水分，可加入无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。脱水100%丙酮H2O50%丙酮H2O90%丙酮H2O70%丙酮15min15min15min20min20min浸透和包埋通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂，使其渗透到组织细胞中去以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的作用，有利于超薄切片。丙酮：包埋剂2：137℃1h丙酮：包埋剂1：137℃1h纯包埋剂37℃1h包埋37℃过夜，45℃24h，65℃24h理想包埋剂Epon812：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较低，易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充分搅拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。Epon812DDSA（十二烷基琥珀酸酐）固化剂：控制软度MNA（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐）固化剂：控制硬度DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚）加速剂包埋剂配方包埋板切片修块切片超薄切片机机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀刃作微小推进。热胀冷缩式推进：利用机内金属杆在加热或冷却的微小变化来推进。判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色，干涉色与切厚度的关系是：灰色40-50nm分辨率高，反差小银白色50-70nm金黄色70-90nm分辨率低，反差好紫色90nm以上电子束不易穿过FORMVAR膜制备Formvar（PVF）溶于纯二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液染色组织细胞的成分主要由碳、氢、氧、氮等低原子序数的元素组成，不能形成足够的反差。利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程度以增强反差。染色剂30min左右与CO2接触会形成不溶性碳酸铅沉淀10min左右半薄切片制作可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。修块时，将切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯胺蓝染色观察。超薄切片制样程序2-3%戊二醛固定液中4℃，2小时或更长时间。磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。1%锇酸2h磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。（可4℃过夜）•取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块•固定：50%丙酮15min70%丙酮15min90%丙酮15min100%丙酮2次，每次20min•脱水：100%丙酮：Epon812=2:11h;100%...
