透射电镜样本的制备VIP免费

透射电镜样本的制备超薄切片制样负染超薄切片由于电子的穿透能力弱，一般的组织细胞的切片，无法在电镜下获得清晰的图像。阻碍了电子显微镜的发展。1957年，英国Huxley发明超薄切片机。超薄切片制片过程取材取材具体方法将动物麻醉或急性处死，暴露的所需脏器。用锋利剪刀剪下一小块组织，放到滴有预冷固定液的蜡片上。将组织切成细长条，再将其切成小块（1mm3）。将小块移至装有预冷固定液的清洁小瓶内。若组织块带有血液而使小瓶内固定液浑浊，应更换新鲜固定液，然后置于4℃冰箱内固定。固定目的：尽可能完整保存细胞在活体状态时的超微结构细节，避免自身酶的分解而出现自溶，或因外界微生物的侵入繁殖而产生腐败，致使细胞的超微结构遭受破坏。同时使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后的冲洗和脱水时溶解和流失。固定方法化学固定：浸泡固定，原位固定，灌注固定物理固定：冷冻固定，微波固定，临界点干燥固定灌注固定通过血液循环的途径将醛类固定液灌流到所要男友定的组织中，待组织适度硬化后，切取所需组织。此法固定迅速而均匀，可同时保存酶的活性和组织超微结构。适用于取材柔软组织或难以浸透、死后变化快的组织和器官，如对中枢神经系统、视网膜和肾脏等组织的固定。理想固定剂常用固定剂固定方法——戊二醛-锇酸双固定先用2.5%戊二醛固定2h以上。缓冲液多次清洗（pH7.40.2mol/L磷酸缓冲液洗三次，15min/次）。1%锇酸固定2h。清洗组织在固定后，应用清洗液洗去残留的固定液残留的醛可与锇酸反应产物细的电子致密的还原锇。锇酸可与乙醇作用生成沉淀。清洗液采用与固定液同系列的缓冲液。（磷酸缓冲液，二甲砷酸钠缓冲液）脱水去除样品中的水，为包埋剂的均匀浸透做准备常用脱水剂乙醇，与环氧树脂的互溶性差，需用环氧丙烷作为中间溶剂进行转换。丙酮市售的无水丙酮含少量水分，可加入无水硫酸钠或硫酸铜等干燥剂吸去水分。脱水100%丙酮H2O50%丙酮H2O90%丙酮H2O70%丙酮15min15min15min20min20min浸透和包埋通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂逐渐取代脱水剂，使其渗透到组织细胞中去以包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片时的各种力的作用，有利于超薄切片。丙酮：包埋剂2：137℃1h丙酮：包埋剂1：137℃1h纯包埋剂37℃1h包埋37℃过夜，45℃24h，65℃24h理想包埋剂Epon812：环氧树脂包埋剂。淡黄色液体，黏度较低，易渗入组织，对细胞结构保存好，在配制时需充分搅拌。聚合后成为具有稳定三维空间结构的固体。Epon812DDSA（十二烷基琥珀酸酐）固化剂：控制软度MNA（甲基内次甲基邻苯二甲酸酐）固化剂：控制硬度DMP-30（2,4,6三，二甲氨基甲基苯酚）加速剂包埋剂配方包埋板切片修块切片超薄切片机机械推进式：通过微动螺悬及微动杠杆使标本臂向刀刃作微小推进。热胀冷缩式推进：利用机内金属杆在加热或冷却的微小变化来推进。判断切片厚度：利用切片反射的光和从切片下水面反射光发生干涉，不同厚度切片在显微镜下呈现不同的干涉色，干涉色与切厚度的关系是：灰色40-50nm分辨率高，反差小银白色50-70nm金黄色70-90nm分辨率低，反差好紫色90nm以上电子束不易穿过FORMVAR膜制备Formvar（PVF）溶于纯二氯乙烯制成0.2-0.5%的制膜液染色组织细胞的成分主要由碳、氢、氧、氮等低原子序数的元素组成，不能形成足够的反差。利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同，使各细胞结构对电子产生不同散射程度以增强反差。染色剂30min左右与CO2接触会形成不溶性碳酸铅沉淀10min左右半薄切片制作可进行定位，克服超薄切片盲目性，提高电镜观察的效果。修块时，将切片修得大一些，切成1μm的厚片，甲苯胺蓝染色观察。超薄切片制样程序2-3%戊二醛固定液中4℃，2小时或更长时间。磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。1%锇酸2h磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。（可4℃过夜）•取材：处死实验动物后半分钟到1分钟内，最多15分钟取出1mm3的组织块•固定：50%丙酮15min70%丙酮15min90%丙酮15min100%丙酮2次，每次20min•脱水：100%丙酮：Epon812=2:11h;100%...