蛋白质分离技术一、电泳简介二、一维等电聚焦电泳三、二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳四、胶上蛋白质的检测（显色）五、存在的问题目前常用的分离技术1）凝胶电泳技术1DGelElectrophoresis2DGelElectrophoresisCapillaryElectrophoresis2）色谱技术HPLCMudPIT4双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。基本原理：第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。发展历史发展概况：合成载体两性电解质（syntheticcarrierampholyte,SCA）来生成PH梯度非平衡PH梯度电泳（non-equilibriumPHgradientelectrophoresis,NEPHGE）固相PH梯度及与载体两性电解质两者混用合成载体两性电解质1975年，O’Farrell首次发表了分离大肠杆菌的双向电泳优化方法，并成功地分离约1000个E.coli蛋白。利用了合成载体两性电解质（SCA）来生成PH梯度是混合的复合物，合成过程复杂，重复性小。SCA的pH梯度不稳定且分子小易漂移，难以固定在IEF胶内，由于水引起的电渗流导致阴极漂移现象，大于7的蛋白丢失很多非平衡pH梯度电泳用来分离碱性蛋白。碱性蛋白迁移速度比酸性蛋白快，将蛋白加在酸性部分，缩短电泳时间短重现性仍然很差固相pH梯度及与载体两性电解质两者混用1975年，Gasparic等合成了固相PH介质，1982年，固相pH梯度等电聚焦技术基本完善具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺的共价聚合，可以形成固定的，不随环境变化的PH梯度PH范围可以在2.5-11，所以几乎在一张双向电泳图谱上可以得到整个细胞产物的分离点分辨率比传统的等电聚焦要更高，可达0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法聚丙烯酰胺凝胶2012-03-199由于聚丙烯酰胺凝胶的凝胶孔径与蛋白质大小接近，能达到最好的分离能力，且制胶方便，成本低，重复性好，凝胶透明，易于显色并观察，为首选的蛋白质分离介质。聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG）是通过丙烯酰胺（acrylamide）单体和双功能团交联剂如N,N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide）按一定的比例混合，在引发剂和增速剂存在下聚合而成的交叉网状结构。二、第一向等电聚焦（IEF）2012-03-1911等电聚焦（IEF）技术是根据蛋白质的等电点（pI）不同将它们分开的一种电泳技术。蛋白质是两性分子；它们整个分子要么带有正电或负电，要么不带电，这依赖于环境的pH值。等电点(isoelectricpoint,pI)是一个特定的pH值，此时整个蛋白质分子的净电荷为零。pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在pH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所净电荷为零的点移动。这就是等电聚焦效应。分离的程度取决于pH梯度斜率和电场强度。因此，等电聚焦是在相当高的电压下进行的（一般超过1000V）。当蛋白质在pH梯度上都达到最终点时，在整个体系中很少有离子的移动，从而使最终电流很低（往往低于mA）。给定样品在给定电泳体系中进行等电聚焦，一般要达一定伏小时（伏小时(Vh)是电压对于作用时间积分），但每条IPG胶条的电流不宜超过50μA。等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)2012-03-1915传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，GÖrg等成功地将之应用于双向电泳。目前，主要应用如：AmershamBiosciences的Immobline试剂的固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)。IPG胶的材料是Immobilines，为拥有8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。将酸性和碱性的缓冲基团共价结合聚丙烯酰胺凝胶而形成IPG。ImmobilineDryStripgelsAmershamBiosciencesAmershamBiosciences产品：长度为7、11、13、18和24cm。pH3-10L胶条在pH3-10之间具有线性的pH值梯度固相pH梯度选择使用3-10pH梯度范围的凝...
