蛋白质分离技术VIP免费

蛋白质分离技术一、电泳简介二、一维等电聚焦电泳三、二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳四、胶上蛋白质的检测（显色）五、存在的问题目前常用的分离技术1）凝胶电泳技术1DGelElectrophoresis2DGelElectrophoresisCapillaryElectrophoresis2）色谱技术HPLCMudPIT4双向凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。基本原理：第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。发展历史发展概况：合成载体两性电解质（syntheticcarrierampholyte,SCA）来生成PH梯度非平衡PH梯度电泳（non-equilibriumPHgradientelectrophoresis,NEPHGE）固相PH梯度及与载体两性电解质两者混用合成载体两性电解质1975年，O’Farrell首次发表了分离大肠杆菌的双向电泳优化方法，并成功地分离约1000个E.coli蛋白。利用了合成载体两性电解质（SCA）来生成PH梯度是混合的复合物，合成过程复杂，重复性小。SCA的pH梯度不稳定且分子小易漂移，难以固定在IEF胶内，由于水引起的电渗流导致阴极漂移现象，大于7的蛋白丢失很多非平衡pH梯度电泳用来分离碱性蛋白。碱性蛋白迁移速度比酸性蛋白快，将蛋白加在酸性部分，缩短电泳时间短重现性仍然很差固相pH梯度及与载体两性电解质两者混用1975年，Gasparic等合成了固相PH介质，1982年，固相pH梯度等电聚焦技术基本完善具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺的共价聚合，可以形成固定的，不随环境变化的PH梯度PH范围可以在2.5-11，所以几乎在一张双向电泳图谱上可以得到整个细胞产物的分离点分辨率比传统的等电聚焦要更高，可达0.001pH，是目前分辨率最高的电泳方法聚丙烯酰胺凝胶2012-03-199由于聚丙烯酰胺凝胶的凝胶孔径与蛋白质大小接近，能达到最好的分离能力，且制胶方便，成本低，重复性好，凝胶透明，易于显色并观察，为首选的蛋白质分离介质。聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PAG）是通过丙烯酰胺（acrylamide）单体和双功能团交联剂如N,N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide）按一定的比例混合，在引发剂和增速剂存在下聚合而成的交叉网状结构。二、第一向等电聚焦（IEF）2012-03-1911等电聚焦（IEF）技术是根据蛋白质的等电点（pI）不同将它们分开的一种电泳技术。蛋白质是两性分子；它们整个分子要么带有正电或负电，要么不带电，这依赖于环境的pH值。等电点(isoelectricpoint,pI)是一个特定的pH值，此时整个蛋白质分子的净电荷为零。pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。在pH梯度凝胶内，在电场作用下，蛋白质分子能向使它们所净电荷为零的点移动。这就是等电聚焦效应。分离的程度取决于pH梯度斜率和电场强度。因此，等电聚焦是在相当高的电压下进行的（一般超过1000V）。当蛋白质在pH梯度上都达到最终点时，在整个体系中很少有离子的移动，从而使最终电流很低（往往低于mA）。给定样品在给定电泳体系中进行等电聚焦，一般要达一定伏小时（伏小时(Vh)是电压对于作用时间积分），但每条IPG胶条的电流不宜超过50μA。等电聚焦在变性条件下进行，能产生高分辩率和高清晰度的结果。利用尿素和去污剂的混合液，能达到完全的变性和溶解，确保各种蛋白质以单一形态存在，并且减少凝集和分子间的相互作用。固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)2012-03-1915传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，GÖrg等成功地将之应用于双向电泳。目前，主要应用如：AmershamBiosciences的Immobline试剂的固相pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)。IPG胶的材料是Immobilines，为拥有8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH3~10不同值的缓冲体系。将酸性和碱性的缓冲基团共价结合聚丙烯酰胺凝胶而形成IPG。ImmobilineDryStripgelsAmershamBiosciencesAmershamBiosciences产品：长度为7、11、13、18和24cm。pH3-10L胶条在pH3-10之间具有线性的pH值梯度固相pH梯度选择使用3-10pH梯度范围的凝...