http://www.paper.edu.cn-1-斑马鱼视神经损伤后视网膜和顶盖系统BCL-2基因的表达郭蕴郦，王子仁兰州大学生命科学学院发育生物所，甘肃兰州（730000）E-mail：guoyunli1@sohu.com摘要：利用荧光定量PCR技术测定斑马鱼（Brachydaniorerio）视神经损伤后凋亡抑制基因Ｂcl-12的表达，以便确定斑马鱼视神经再生所需的周期。结果发现：斑马鱼视神经再生过程中在不同实验时间点Bcl-2基因的表达差异明显，从损伤视神经后1-7d的低表达，到损伤视神经后30d基本恢复到正常水平。这表明斑马鱼在损伤视神经后的再生过程中，可以利用细胞凋亡相关基因的表达变化进行视神经再生周期的确定。并发现Bcl-2基因在顶盖和视网膜损伤后5d均大量表达，顶盖中更是达到了峰值，稍早于视神经再生回其上行和下行靶组织的时间。推测可能是由于神经胶质细胞的作用，提前抑制了靶组织的细胞凋亡，从而为神经再生回靶组织提供条件。关键词：视神经再生；视网膜；顶盖；免疫荧光定量PCR（FQ-PCR）；Bcl-2中图分类号：Q1891．引言凋亡作为一种生命现象，具有维持正常组织器官平衡稳定及组织器官损伤后修复的作用。大量的动物实验表明凋亡是视网膜神经节细胞死亡的重要机制之一[1]。鱼类和两栖类的视神经作为外周神经系统的一部分，具有再生的能力[2]。已知视神经的损伤对与视神经纤维直接相连的视网膜神经节细胞的形态学变化，以及与视神经再生相关的蛋白质的合成等产生影响[2]。同时，在神经网络中，对其上行系统也具有一定的跨神经元的影响[2]。这种影响不只反应在组织结构的变化水平上，更重要的是在分子水平的改变。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程。在这些基因中，BCL-2家族起着重要的作用。这一家族有众多成员，如Mcl-1、NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，它们分别既有抗凋亡作用，也有促凋亡的作用。多数成员间有两个结构同源区域，在介导成员之间的二聚体化过程中起重要作用。Bcl-2成员之间的二聚体化是成员之间功能实现或功能调节的重要形式。Bcl-2生理功能是阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。Bcl-2的亚细胞定位已经明确，它在不同的细胞类型可以定位于线粒体、内质网以及核膜上，并通过阻止线粒体细胞色素C的释放而发挥抗凋亡作用。此外，Bcl-2具有保护细胞的功能，Bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽（GSH）的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低了Caspase的活性[3]。本实验采取探针法荧光定量PCR技术，以斑马鱼（Brachydaniorerio）为材料，在分子水平检测Bcl-2基因的表达，来观测损伤视神经对视网膜和顶盖系统细胞凋亡的影响。2.材料与方法2.1材料1本课题得到国家自然科学基金项目（No.30670230）的资助。http://www.paper.edu.cn-2-选取成年斑马鱼（Brachydaniorerio）体长2.5cm左右，雌雄不论，自花鱼市场购回后在实验室进行2周以上饲养之后进行实验。取正常发育的成年斑马鱼，5‰Finquel(tricainmethanesulfonate)麻醉剂麻醉后，用眼科镊在眼球底部位置夹断视神经，苏醒后继续实验室饲养，直到实验取材。分别于视神经损伤后1d、2d、5d、7d和30d，经上述同样麻醉后取个体双眼的视网膜和顶盖作为实验材料。每个损伤周期取3个平行样本。取正常斑马鱼个体双眼的视网膜和顶盖作为对照。将取出的新鲜组织迅速放入液氮罐（-80℃）中保存备用。2.2总RNA提取使用H.Q.Q总RNA提取试剂盒Ⅱ（安徽优晶生物工程有限公司）进行总RNA的提取。从液氮罐中取出保存的组织，立即放入预冷的组织研磨器中，加入1mlRZ裂解缓冲液Ⅱ，充分研磨，室温下温育5min，以裂解组织。将裂解混合液移入2mlEnpendorff管中，加入200µl氯仿，漩涡混匀20s。412000℃g离心10min，取上层水相，加入等体积75%乙醇，彻底漩涡混匀后，将混合液体加到Mu-PuRNA提取柱上，按照说明书要求，用试剂盒中的洗涤缓冲液进行提纯。在提纯后的Mu-PuRNA提取柱中加入100µlDEPC水进...
