1GENMEDSCIENTIFICSINC.U.S.AGMS10014.2v.AGENMED纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书（中文版）主要用途GENMED纯化线粒体细胞色素C氧化酶活性测定试剂是一种旨在通过测定纯化的可溶性完整线粒体样品中的细胞色素C氧化酶的活性，即采用比色法测定受到细胞色素C氧化酶催化的氧化反应的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种线粒体（动物、人体、植物、昆虫等）细胞色素C氧化酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简捷，性能稳定。技术背景细胞色素C氧化酶（Cytochromecoxidase）存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。作为线粒体外膜功能的生物标记，通过线粒体膜上的酶活性变化，来衡量线粒体外膜的完整性：基于还原型细胞色素C（reducedcytochromec）转化为氧化型细胞色素C（oxidizedcytochromec）的变化（550nm波长），来定量测定细胞色素C氧化酶的活性。细胞色素C氧化酶反应系统为：产品内容GENMED缓冲液（ReagentA）毫升GENMED反应液（ReagentB）毫升GENMED稀释液（ReagentC）毫升GENMED稳定液（ReagentD）微升产品说明书1份保存方式GENMED缓冲液（ReagentA）和GENMED稀释液（ReagentC）保存在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；GENMED反应液（ReagentB）避免光照；有效保证12月用户自备1.5毫升离心管：用于反应液配制的容器石英比色杯：用于比色的容器分光光度仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的GENMED反应液（ReagentB）置入冰槽里融化，然后移出100()()++++++⎯⎯⎯⎯⎯→⎯++4HO2Hccytochrome4O8Hccytochrome423低吸收峰氧化型氧化酶C细胞色素22高吸收峰还原型2微升到新的1.5毫升离心管，加入微升GENMED稳定液（ReagentD），轻柔混匀后，室温下避光静置至少15分钟（可见颜色变化），置于冰槽里，标记为GENMED反应工作液（注意：见注意事项4），放在暗室里备用。然后进行下列操作。一、测读准备1．准备好含有细胞色素C氧化酶的样品（例如纯化的线粒体样品等），置于冰槽里融化2．设定好分光光度仪：温度25℃，波长550nm，时延5秒，间隔10秒，测读6次（共60秒），并置零或设置0秒和60秒各测读1次二、背景对照测定3．移取微升GENMED缓冲液（ReagentA）到新的1毫升比色杯4．加入微升GENMED稀释液（ReagentC）5．放入分光光度仪，置零6．取出比色杯，加入微升含有GENMED反应液（ReagentB）和GENMED稳定液（ReagentD）的GENMED反应工作液7．上下倾倒数次，混匀8．即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照（0秒读数－60秒读数），正常读数差值为0.001至0.005三、样品测定9．移取微升GENMED缓冲液（ReagentA）到新的比色杯10．加入100微升待测样品（注意：建议总量2微克线粒体蛋白：完整线粒体而非裂解形式）11．上下倾倒数次，混匀12．放入分光光度仪，置零13．取出比色杯，加入微升含有GENMED反应液（ReagentB）和GENMED稳定液（ReagentD）的GENMED反应工作液14．即刻上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）15．即刻放入分光光度仪检测，此为样品读数（0秒读数－60秒读数），通常活性读数差值为正数16．（选择步骤）重复实验步骤9至15，测读新的样品四、计算样品活性：方法一：按照操作步骤规定()()111-1mlminCmlmin84.21ml1.0−−−⋅⋅⋅⋅•×−摩尔细胞色素单位＝样品活性摩尔吸光系数样品蛋白容量背景读数样品读数或()()111-1mgminCmgmin84.21.002mg0−−−⋅⋅⋅⋅•×−摩尔细胞色素单位＝样品活性摩尔吸光系数样品蛋白量背景读数样品读数或方法二：未知待测样品蛋白浓度()()111-1mlminCmlmin84.21ml1.0−−−⋅⋅⋅⋅•××−摩尔细胞色素单位＝样品活性摩尔吸光系数样品蛋白容量样品稀释倍数背景读数）（样品读数或3111-11-11-11mgminCmgminmlmgmlminCmlmin−−−−−−⋅⋅⋅⋅•=⋅•⋅⋅⋅⋅•摩尔细胞色素单位样品活性样品蛋白浓度摩尔细胞色素单位样品活性或或注意事项1．本产品为20次操作，包括背景对照2．操作时，须戴手套3．线粒体样品中忌用DTT和巯基乙醇等处理4．每增加1个样品，增加GENMED反应工作液为：GENMED反应...
