中国兽医学报990221中国兽医学报CHINESEJOURNALOFVETERINARYSCIENCE1999年第19卷第2期No.2vol.191999ELISA测定乳中磺胺甲基嘧啶残留*吴定张羽航**姚汝华**摘要以牛血清白蛋白(BSA)为载体，合成2种不同的物质的量的比值(约1∶13和1∶42)的磺胺甲基嘧啶抗原，并比较了两者的免疫原性；以卵白蛋白(OA)为载体，合成1种包被抗原；用辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，工作浓度1∶1000；建立的乳中磺胺甲基嘧啶残留ELISA测定法，抗原亲和常数分别为1.28×107（1∶42）和3.21×107(1∶13)，磺胺甲基嘧啶检测质量浓度为5～220μg/L(1.87×10－8～8.2×10－7mol/L)，检测限为2.4μg/L,回收率为88%～118%，与磺胺二甲基嘧啶和磺胺噻唑交叉率分别为6.0%和0.84%，与磺胺二甲氧嘧啶和磺胺脒无交叉反应。关键词乳磺胺甲基嘧啶ELISA中图分类号S854.43Enzyme-linkedImmunosorbentAssayonSulfamethyldiazineContentinMilkWuDingZhangYuhang*YaoRuhua*(AnhuiAgrotechnicalTeachersCollege,Fengyang,Anhui233100)AbstractTwokindsofthesulfamethyldiazineantigenweresynthesisedwiththecarrierproteinofBSAorOAandtheirimmunogenicitycompared;thesheepanti-rabbitγ-globulinwerelabelledwiththehorseradishperoxidase(HRP)accordingtosodiumperiodatemethod;theELISAonsulfamethyldiazinecontentinmilkwasdeveloped.Affinityconstantoftheantibodywas1.28×107(themolecularmoleratioinantigenfor1∶42)and3.21×107(1∶13),respectively.ThedetectableconcentrationofsulfamethyldiazinewithELISArevealed5-220μg/L(1.87×10-8-8.2×10-7mol/L)withthedetectionlimitbeing2.4μg/L,therecoveryrateof89%-118%,thecrossreactiveratewithsulfadimidineandsulfathiazoleof6.0%and0.84%,respectively,nocrossreactionwithsulfadimethoxineandsulfaguaniline.Keywordssulfamethyldiazine;enzyme-likedimmunosorbentassay;ELISA磺胺甲基嘧啶是治疗奶牛疾病和作饲料添加剂的常用药物之一。奶牛使用抗生素后，一般经72h就可挤乳出售［1］。但磺胺甲基嘧啶半衰期较长，72h后鲜乳中仍有微量残留［2，3］。食用含磺胺甲基嘧啶的牛乳，能导致过敏机体发生过敏性反应，破坏机体正常菌群生态平衡，引起致病菌产生耐药性［4］。乳中抗生素残留的测定一般采用TTC法和微生物抑制圈法，但不适合乳中磺胺药残留测定［5～7］。本研究在合成牛血清白蛋白-磺胺甲基嘧啶抗原和卵白蛋白-磺胺甲基嘧啶抗原，并在比较2种不同分子file:///E|/qk/zgsyxb/zgsy99/zgsy9902/990221.htm（第1／5页）2010-3-2316:43:25中国兽医学报990221结合比偶合抗原免疫原性的基础上，建立了乳中磺胺甲基嘧啶残留的ELISA测定方法。1材料与方法1.1主要试剂与仪器磺胺甲基嘧啶(SMD)(山东第四制药厂)、吡啶(上海化学试剂厂)、丁二酸酐(SA)(上海化学试剂厂)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)(Merck公司)、N，N′-二甲基甲酰胺(上海化学试剂厂)、牛血清白蛋白(BSA)(上海生化所)、卵白蛋白(OA)(上海血研所)、辣根过氧化物酶(HRP)(RZ>3.0，上海生化所)、羊抗兔IgG(天津生物制品研究中心)、硼氢化钾(Fluck公司)、过碘酸钾(上海试剂一厂)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma公司)。UV-754型紫外可见分光光度计(上海第三分析厂)、DG-3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。1.2抗原偶联与抗血清制备1.2.1SMD-SA制备取SMD1.33g、SA2.67g，溶于15mL无水吡啶中，室温静置反应24h后，转移至20mL蒸馏水中，用二氯甲烷萃取3次，合并萃取液，用0.1mol/L盐酸洗3次，然后用蒸馏水洗1次。将二氯甲烷萃取液经无水Na2SO4脱水，然后加甲苯置真空干燥器(50℃)烘干，得到SMD-SA粉，再置蒸馏水中重结晶，得纯品SMD-SA。1.2.2SMD-SA-BSA(或OA)偶联取SMD-SA10.4mg、EDC11.0mg，加入1.0mLN，N′-二甲基甲酰胺中，然后滴入含BSA或OA缓冲液1.0mL，再加6mol/LNaOH液20μL，搅拌反应6h后，再加EDC10.7mg，室温搅拌过夜，经pH7.2缓冲液透析，透析液4℃保存。1.2.3合成抗原鉴定合成的SMD-BSA和SMD-OA抗原以光谱扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定［8］。1.2.4抗血清制备与纯化取SMD-...
