蛋白质电泳操作步骤VIP免费

SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1g丙烯酰胺和0.9g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100ml，过滤备用。(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1mol/LTris-HCl，pH6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06gTris溶解于35ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50ml。（3）分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl，pH8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16gTris溶解于75ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100ml。（4）10%SDS（5）10%过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×)（棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025mol/LTris，0.192mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3（9）电极缓冲液(2×)（棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050mol/LTris，0.384mol/L甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3（10）样品缓冲液（pH6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6ml浓缩胶缓冲液（pH6.8）+4ml10%SDS+0.6g二硫苏糖醇(DTT)+2.5ml87%甘油+0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250ml乙醇，80ml冰醋酸，加水稀释至1000ml。c．染色液称取0.29g考玛斯亮蓝R-250溶于250ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。.CytC酶解样每管分别加入8µl细胞色素C（20mg/ml），10ul50mMTris-HCl（pH8.0）,1µl胰蛋白酶（细胞色素C：胰蛋白酶=50：1）。37℃水浴，2h。立即放入-20℃冰箱冷冻保存备用。上样前加15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min大肠杆菌蛋白取10μІ工程菌种接入10nmlLB液体培养基里，过夜培养12h，取出1ml菌液离心10000g/r，5min。弃上清，用1mlTris-Hcl（pH8.050mM）洗涤1-2次，后分别加入20μІ（pH8.05mM）、10μІEDTA，-20℃保存。上样前加入2μІ5%X，再加入50μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min.CytC15μІCytC加入15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min.低分子量肽标准取8-10μІMaker（2mg/ml）,加入10μІ上样buffer，再加入5μІddH2O，75℃水浴5-10min.SPI多肽的制备Ⅰ材料及试剂（试剂均为分析纯）纯大豆粉木瓜蛋白酶（sigmaP3250500-2000AU/g）正己烷巯基乙醇Tris-HCl缓冲液（0.03M、pH8.0）0.2MHCl叠氮钠考马斯亮蓝G250标准牛血蛋白Ⅱ制备方法ⅰ.SPI制备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi和Yamauchi[9]的方法,具体步骤如下:全脂豆粉加正己烷(1/5)室温下搅拌1h脱脂，于3000g离心5min,取沉淀反复脱脂两次,于沉淀中加入15～20倍含10mM巯基乙醇0.03M、pH8.0的Tris-HCl缓冲液,室温搅拌1～2h,于20℃6000g离心25min,取上清液,用0.2MHCl调节pH至4.8,置于冰箱下层冷沉过夜,再于4℃9000g离心20min,取沉淀分散于少量水中,调节pH至7.0,搅拌1h充分溶解后于4℃下用含0.05%叠氮钠的蒸馏水透析2d,再用蒸馏水透析两次去叠氮钠,冷冻干燥即得大豆分离蛋白(SPI)。（可能透析会损失掉一定量的多肽。）ⅱ.SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的标准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见《生物化学实验原理和方法》P174）标准蛋白曲线0.4530.5590.7250.7680.841.0351.1600.20.40.60.811.21.400.010.020.030.040.050.06蛋白浓度吸光度吸光度线性(吸光度)测得1%（1mg/ml）的SPI吸光度为0.779，求得即在SPI质量分数为1%的情况下，其蛋白浓度约为3mg/ml.ⅲ.SPI多肽制备：本实验采用木瓜蛋白酶水解SPI，制取SPI多肽。标准的酶解体系为溶于0.05mol/L,pH8.0Tris-HCl缓冲溶液的SPI溶液(质量分数为2%),含质量分数为0.05%的叠氮钠,先于38℃下预热5min,分别添加蛋白酶至750AU/mL，然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响SPI多肽的产率，木瓜蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。反应混合物可定期取样并分别加入X-PAGE样品缓冲液终止反应(1:1,v/v)。实验上样一般采用过夜酶解透析样(2%*...