豆奶蛋白质中巯基含量的测定VIP免费

第3卷第2期中国．食品学报v01．3No．211Q!堑!旦!竺型垒些!竺垫墅些!垡!型墅竺矍型!坠!!!型!!!．!!!!豆奶蛋白质中巯基含量的测定欧仕益。郭乾初2包惠燕‘李爱军1(1暨南大学食品科学与工程系广州5106322香港理工大学应用生物与化学科技系香港)摘要Ellman法是测定蛋白质中游离巯基和二硫键含量的快速、简便的方法．但谊法用于测定豆奶等的巯基含量时，由于溶液高度混浊和巯基含量不高，给测定带来了困难。本实验先采用丙酮将豆奶中的蛋白质沉淀分离，再用含8md／L尿素的T—s甘氨酸缓冲溶液或不合尿素的Tris一甘氨醢缓冲溶液溶解，使蛋白质溶液的混浊度大大下降，从而能选到用分光度法准确测定豆奶蛋白质中巯基含量的目的。采用大豆分离蛋白作时照实验表明，丙酮处理不会影响蛋白质中的巯基含量，说明丙酮处理是测定高混浊度蛋白质溶液如牛奶、豆奶中的蛋白质巯基含量的一种有效方法。关键词蛋白质混浊巯基文章编号10097848(2003)02—0059—04蛋白质中的巯基(一SH)和二硫键(一Ss—bond)具有很高的反应活性，在发挥蛋白质的食品功能性质中起着重要作用o。，如面筋、凝胶的形成”’3。、蛋白质的成膜等。都与一SH转化成一S—S—bond有关。此外一些加工方法如加热、氧化剂和还原剂的处理都会引起巯基和二硫键的变化”’51。因此，在探讨食品中蛋白质性质时，经常要测定巯基和二硫键含量的变化。目前，普遍采用的是Ellman(1959)发明的方法”』，即利用5，5’二硫代2一硝基苯甲酸(D1、NB)与游离SH反应，在412nm处生成有最大吸收峰的黄色物质后，采用分光光度法测定。无疑，该法简单、快速、直接，是测定纯蛋白质溶液中巯基的一种理想方法。但是，直接用于测定混浊的蛋白质溶液如牛奶、豆奶中的巯基时却因这些溶液高度混浊而产生较大偏差。这是所有分光光度法，包括紫外分光光度法”1遇到的共同问题。本实验采用丙酮先破坏乳化体系，将蛋白质沉淀，再用含变性剂尿素的"Iris一甘氨酸缓冲液溶解并测定巯基含量，取得了较理想的结果。收稿日期：20021215作者简介：欧仁益，男，1963年出生，副教授1材料与方法11豆奶的制备按Kwok等”⋯的方法进行。市售大豆加10倍水(w／w)浸泡12h，采用高速组织捣碎机(Waxing公司产)在低速档下捣碎5min。用200目的尼龙布袋过滤，获得固型物含量为65mg／mL，蛋白质含量约3．5％的豆奶。1．2试剂的配制缓冲溶液1：每升溶液含10．49Tris，6．99甘氨酸，1．29EDTA，pH=8．0。缓冲溶液2：每升溶液含10．49Tris，6．99甘氨酸，1．29EDTA，4809尿素，pH=8．0。缓冲溶液3：每升溶液含10．49Tris，6．99甘氨酸，1．29EIYFA，6009尿素，pH-8．0。Ellman试剂：0．29DTNB溶于50mL缓冲溶液1中。12％TeA：每升溶液含1209三氯醋酸。13豆奶的热处理在带塞试管中进行热处理。每试管中加入10mL豆奶，拧紧塞，置于95℃的水浴中，处理时间分别为45、90、135、180min。每种处理重复3次。14豆奶的丙酮处理取1mL豆奶十9mL无水丙酮，搅拌后静置万方数据中国食品学报2003年第2魁10rain，30009下离心15rain，沉淀用5mL丙酮悬浮，离心(30009，15min)2次，高压冷风吹干丙酮，加5mL缓冲溶液1，测表面的SH基，加5mL缓冲溶液2，测总的游离sH。取未用丙酮处理的豆奶1mL，加八4mL缓冲溶液1充分混溶，测表面游离SH，或加缓冲溶液2，测总的游离SH。15巯基和二硫键的测定1．5．1游离巯基的测定取lmI，在1．4中配制的豆奶溶液十2．0mL缓冲溶液1或2+0．02mLEllman试剂，25℃保温5min，采用日立u1500型分光光度计，在412nm下测定吸光值。实验以不加豆奶，而加ElLman试剂为空白(仪器复0)，以不加EHman试剂，而加豆奶的溶液确定其混浊度。1．5．2蛋白质中胱氨酸总量的测定从1．4配制的溶液中取0．2mL豆奶}1mL缓冲溶液3+0．02mL巯基乙醇，25℃保温1h，加入10mL12％TCA，25℃保温1h，50009离心15min，沉淀用5mL12％TCA悬浮，离心(50009，10min)，如此2次。沉淀用3．0mL缓冲溶液1溶解，加入0．05mLEllman试剂，5rain后在412ran下测定其吸光值。同时设置不加Ellman试剂作对照以比较其混浊度。1．5．3计算按卜'式计算SH和胱氨酸含量”“SH(pmol／g)=(73．53×^12×D)／C气I：—有DTNB存在时豆奶的吸光值一无DTNB...