江南大学博士学位论文答辩有机酸工艺学提升光滑球拟酵母酸耐受性加强丙酮酸合成主讲教师：徐国强xuguoqiang@jiangnan.edu.cn2015-4-20研究背景�硫胺素（维生素B1)、生物素、烟酸、盐酸吡哆醇4种维生素营养缺陷型菌株,丙酮酸高产菌�进化上与酿酒酵母在常见的酵母中最为接近常见酵母进化分析光滑球拟酵母代谢途径引自汪军硕士论文光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸存在的问题饥饿胁迫渗透压胁迫酸胁迫氧胁迫温度胁迫酸胁迫是光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸所面临的主要胁迫，增强光滑球拟酵母抵御酸胁迫的能力，减轻高浓度丙酮酸引起的酸胁迫抑制，可以进一步提高丙酮酸发酵工艺的产量、产率和生产强度。研究思路适应性进化提高光滑球拟酵母耐酸性原菌突变菌光滑球拟酵母酸胁迫条件下生理特性研究发酵条件优化提高丙酮酸产量研究内容一Part1Part1适应性进化提高光滑球拟酵母耐酸性1.1酸胁迫对T.galbrata生长及发酵产丙酮酸的影响5.55.04.54.003691215Pyruvate(g/L)DCW(g/L)5.55.04.54.001020304050ExteralpHExteralpH不同pH值条件下对丙酮酸生产影响结果表明，发酵积累的丙酮酸主要从两个方面抑制菌株发酵：一方面通过降低培养基pH；另一方面通过丙酮酸本身毒性。未添加0.5mol/LPYR1.2适应性进化提高T.glabrata耐受高浓度丙酮酸适应性进化示意图以光滑球拟酵母CCTCCM202169为出发菌株，连续转接生长至对数生长中期的菌株至初始pH4.3的新鲜培养基中。共筛选出六株突变株，根据传代次数依次命名为RT-1(360代)，RT-2(720代)，RT-3(1080代)，RT-4(1440代)，RT-5(1800代)，RT-6(2160代)，原菌命名为RT-0。1.3进化突变株酸胁迫抗性考察RT-0RT-1RT-2RT-3RT-4RT-5RT-645678ART-0RT-1RT-2RT-3RT-4RT-5RT-6681012BRT-0RT-1RT-2RT-3RT-4RT-5RT-61.82.02.22.42.62.8CpHoutPyruvate(g/L)DCW(g/L)不同进化时期突变株耐酸性比较从菌浓、丙酮酸产量和发酵培养基终始pH三方面可以得出，进化突变株耐酸性明显提高，且随着进化代数延长，进化菌株耐酸性提高。最终选择突变株RT-6为实验菌株，进行后续研究。1.4突变株RT-6对其它有机酸耐受性结果表明，突变株RT-6不仅对丙酮酸耐受性增加，而且对其他种类有机酸耐受性也增加，且对不同种类有机酸具有不同耐受性。AceticacidLacticacidPropionicacidCitricacid020406080100Viability(%)Organicacids突变株RT-6在各种有机酸胁迫下存活率的比较原菌突变株RT-61.5原菌与突变株RT-6在酸性与正常条件下发酵特性比较081624324048560481216081624324048560481216081624324048560102030405060081624324048560102030405060Pyruvate(g/L)DCW(g/L)Pyruvate(g/L)ABCDTime(h)Time(h)Time(h)Time(h)DCW(g/L)不同pH条件对原菌与突变株丙酮酸发酵的影响BandD:pH5.5;AandC:pH4.7;parentstrain(○);mutantstrain(●)1.6原菌与突变株RT-6在酸性与正常条件下发酵特性比较ParametersParentstrain(A)Evolvedstrain(B)Change(%)[(B/A)-1]×100Fermentationtime(h)5648-14.3Glucoseconsumption(g/L)97.698.30.007Drycellweight(g/L)12.114.721.5Pyruvatetiter(g/L)48.355.815.5Yieldofpyruvateonglucose(g/g)0.4950.56814.7Glucoseconsumptionrate(g/(L⋅h))1.7432.04817.5Pyruvateproductivity(g/(L⋅h))0.8621.16234.8ParametersParentstrain(A)Evolvedstrain(B)Change(%)[(B/A)-1]×100Fermentationtime(h)56560Glucoseconsumption(g/L)63.378.724.3Drycellweight(g/L)5.69.0661.8Pyruvatetiter(g/L)23.735.9751.8Yieldofpyruvateonglucose(g/g)0.3720.45722.8Glucoseconsumptionrate(g/(L⋅h))1.131.4124.8Pyruvateproductivity(g/(L⋅h))0.4230.64251.8pH5.5pH4.7最终发酵周期缩短8h，丙酮酸产量(55.8g/L)、对葡萄糖产率(0.568g/g)和生产强度(1.162g/(L�h))则分别提高了15.5%、14.7%和34.8%。耗糖速度明显加快，丙酮酸产量(35.97g/L)、对葡萄糖产率(0.457g/g)和生产强度(0.642g/(L�h))则分别提高了51.8%、22.8%和51.8%。1.7小结(1)丙酮酸积累主要从两方面抑制丙酮酸合成：一方面降低培养基pH；另一方面通过有机酸本身毒性，扩撒进入胞内，影响胞内内环境；(2)通过适应性进化共筛选六...
