一、立项依据(一)胃癌概述1.胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。2.全球肿瘤发病和癌症死亡率的第二位.3.早期胃癌多无症状或仅有轻微症状。当临床症状明显时，病变已属晚期。4.胃癌缺乏早期特异性的肿瘤诊断标志物，现有肿瘤标志物如CEA灵敏度仅40%，使肿瘤常常发生浸润转移5.肿瘤药物化疗、放射线手段副作用大。对患者正常细胞伤害较大，亟需高特异性的肿瘤药物(二)微小RNA1.已有报道显示，微小RNA与胃癌的发生发展有着密切的关系。2.微小RNA分子(microRNA,miRNA)是非编码的RNA分子(noncodingRNA,ncRNA),对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。3.MicroRNA的主要功能是调节与个体生长、发育、疾病发生过程相关基因的表达,在生物发育过程中发挥着包括早期发育、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤生成等多方面的重要作用,研究miRNA的表达,尤其对其功能研究,对探索生物进化及防治人类疾病具有重要意义。(三)胃癌组织中微小RNA的表达谱•芯片分析胃癌组织中异常表达的微小RNAGuoJ,etal.JGastroenterolHepatol.2009,24(4):652-65719种差异表达的微小RNA127miR-139-5p，miR-497和miR-768-3p首次在非肿瘤组织中发现miR-340*、miR-421和miR-658首次在癌组织中发现高表达二、研究目标microRNA-19a•胃癌细胞→microRNA-19a？microRNA-19a抑制剂•本课题主要研究特异性微小RNA-19a的抑制剂对胃癌细胞增殖的影响，从而为胃癌的治疗提供新的靶点。•初步假设：特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制胃癌细胞的增殖。三、研究内容•设计并合成微小RNA-19a的2’-甲氧修饰的RNA寡核苷酸（微小RNA抑制剂），用脂质体转染到SGC-7901和MGC-803胃癌细胞，然后用实时定量逆转录-聚合酶链反应技术检测微小RNA-19a的表达情况，最后用MTT法检测胃癌细胞的增殖情况。四、可行性分析•微小RNA的抑制剂由生物公司合成并购买•细胞转染实验以及MTT法技术都已普及•实时定量-PCR基础二楼生化教研室可进行本实验五、研究方案设计材料•胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）•DMEM培养液（4°C保存）•胎牛血清•RNA提取Trizol法试剂•转染Lipofectamine2000试剂•实时定量逆转录-聚合酶链反应试剂盒•通用逆转录引物•针对微小RNA-19a而设计PCR扩增的引物•微小RNA抑制剂：抑制微小RNA-19a活性的2’-甲氧修饰的RNA寡核苷酸方法1、细胞培养胃癌SGC-7901和MGC-803细胞在37度、含5%CO2的培养箱中培养。DMEM培养液中含有10%小牛血清。选择对数生长期细胞用于实验。2、细胞转染转染前1d,选择生长状态良好的细胞胃癌细胞，以3×105cells/well的密度接种6孔板，待细胞密度达到50%-70%后，用lipofectamine2000转染试剂按转染试剂盒说明书转染，培养4小时后新鲜培养液。3、细胞总RNA提取及实时定量RT-PCR检测微小RNA的表达水平用Trizol试剂提取细胞内总RNA并测定RNA浓度，逆转录成cDNA，再按说明书进行实时定量PCR，以U6作为小RNA含量的参照。PCR反应条件为：先95度15min热启动，然后按94度15s、60度30s、72度30s，共40个循环。最后通过解链曲线分析扩增产物的特异性。微小RNA的相对表达量用方法来表示，4、MTT法检测胃癌细胞增殖情况以1.5×104cells/well接种胃癌细胞于96孔板，先观察脂质体转染试剂对照组、微小RNA抑制剂阴性对照组和空白对照组3组间细胞生长差异，在确定前2组对细胞的生长没有明显影响的情况下进行一下实验。用3个不同浓度（0.50μmol/L\0.7μmol/L\1.00μmol/L）的微小RNA抑制剂转染细胞，每组设3个复孔。48h后492nm和630nm双波长下检测吸光度（A）值，每组取均值计算细胞抑制率。5、统计学处理数据用SPSS13.0软件分析，两组间均数比较用独立样本t检测，结果用均数±标准差（X±s）表示。¯六、预期研究成果•特异性微小RNA-19a的抑制剂抑制了胃癌细胞当中微小RNA-19a的表达，抑制了胃癌细胞的增殖。七、经费预算•胃癌细胞SGC-7901和MGC-803（购于上海生化所细胞库）•两种试剂盒（购于生物公司）•总费用约5800元八、参考文献TonyBouKheir,EwaFutoma-Kazmierczak,AndersJacobsenAndersKrogh,LindaBardram：miR-449inhibitscellproliferationandisdown-regulatedingastriccancerZhangChun-zhi,HanLei,ZhangAn-ling,FuYan-chao,YueXiao,WangGuang-xiu,JiaZhi-fan1,PuPei-yu：RMeseiacrcrhoarRticNleA-221andmicroRNA-222regulategastriccarcinomacellproliferationandradioresistancebytargetingPTEN蒋振，郭俊明，肖丙秀：特异性微小RNA抑制剂对胃癌细胞增殖的影响
