结核分枝杆菌耐药基因检测及临床应用VIP免费

主生篮鎏瘟盘查!!!；生!!旦釜i!鲞筮!!塑垦!i!』!!!箜!望堡!盟坐!望塾!!!!!!y!!：!!!盟!：!!forthequantificationOfHBVcccDNAbyreal—timePCR．BiochemBiophysResCommun，2002，295：1102—1107，[10]Jun—BinS，ZhiC，Wei—QinN，eta1．AquantitativemethodtodetectHBVeccDNAbychimericprimerandreal—timepolymerasechainreaction．JVirolMethods，2003，112：45—52．[11]SchuhzU．ChisariFV。RecombinantduckinterferongammainhibitsduckhepatitisBvirusreplicationinprimaryhepatocytes，JVirol，1999，73：3162—3168．[t23DandriM．BurdaMR，WillH，etat．IncreasedhepatocyteturnoverandinhibitionofwoodchuckhepatitisBvirusreplicationbyadefovirinvitrodonotleadtOreductionoftheclosedcircularDNA．Hepatology，2000，32：139—146．[13]ChenY，SzeJ，HeMI。．HBVcceDNAinpatients’seraasanindicatorforHBVreactivationandanearlysignalofliverdamage．WorldJGastroenteroI，2004，10：82—85．(收稿日期：2012-07—07)(本文编辑：李欣)结核分枝杆菌耐药基因检测及临床应用王永忠朱珉之支lj小琴张宏宇申红玉濮翔科陈春华王怀诚张钢屠文俊全球约有三分之一的人感染过结核分枝杆菌(TB)，每年因结核分枝杆菌感染死亡的病例达100多万[1]。我国是结核病高负担国家，肺结核病患者达500万，占全球总数的1／4。耐多药结核分枝杆菌(MDR—TB)和广泛耐药结核分枝杆菌(XDR—TB)感染已经对结核病防控工作构成严峻挑战，全球每年880多万新发结核分枝杆菌感染病例中，约有65万感染MDR—TB，我国高达9．3％[2。3]。结核分枝杆菌耐药可以通过药物敏感试验和基因突变检测，前者检测表型耐药，后者检测基因型耐药。基因型耐药检测简便快速，关于基因型耐药与表型耐药，以及不同药物浓度下的表型耐药与基因型耐药的关系鲜见报道。本研究对120株结核分枝杆菌进行了表型耐药与基因型耐药的检测，并分析了新发现的与利福平耐药有关的rpoC基因，现将结果报道如下。对象与方法一、研究对象肺结核患者120例，其中男84例，女36例，年龄14～88岁(中位数48岁)；为常州市第三人民医院2011年4月至2012年3月住院期间确诊的肺结核患者，收集痰液标本进行液化和培养。D01：10．3760／cma．j．issn．1000—6680．2012．11．013基金项目：江苏省常州市应用基础研究资助项目(CJ20122011)作者单位：213001常州市第三人民医院感染科肺结核患者的诊断依据为肺结核诊断标准(WS288—2008)E“。二、仪器与试剂BacT／ALERT一3D分枝杆菌培养仪，培养基为法国生物梅里埃公司产品。结核分枝杆菌DNA提取试剂、PCR扩增体系购自上海复星医学科技发展有限公司，测序引物由美国LifeTechnology公司合成。三、检测方法1．分枝杆菌培养：在生物安全柜内将1～2mL痰液转移至处理管中，加入1～4倍体积的4％氢氧化钠溶液，漩涡振荡30S至痰液充分液化，静置15min，加入PBS至中性，转移至5mL离心管中，6480×g离心15min，弃上清液，加0．5mLPBS混匀，用1mL注射器吸取0．1mL，注入结核培养瓶培养42d。阳性标本转至罗氏培养基，培养生长后用于表型耐药测定。2．表型耐药测定；采用绝对浓度法，培养基由无锡博慧斯生物医药科技公司提供，药物为利福平(50ptg／mL、250／tg／mL)、异烟肼(1／,g／mL、10弘g／mL)、乙胺丁醇(5tzg／mL、50／_￡g／mL)、链霉素(10／Mg／mL、i00／xg／mL)、左氧氟沙星(1／19,／mL、10／-g／mL)，按试剂盒说明书操作。3．PCR扩增及测序：PCR引物序列见表1。PeR反应体系由2肚LDNA模板、5UTaq酶、3mmol／LMgCl2、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)各2mmol／L和缓冲液组成，反应体积20肚L。万方数据主坐篮鍪疸盘查!!!!生!!旦箜i!鲞筮!!翅壁蔓!』!!!笪!垡!!婪!!!婴!墅垫!!!y!!：i!!盟!：!!·697·表l聚合酶链反应扩增引物序列基因上游引物(5’一3’)下游引物(S’一3’)长度(bp)rpoBTCACACCGCAGACGTTGATAGCCGATCAGACCGATGTT269katGCATGAACGACGTCGAAACAGCTCTTCGTCAGCTCCCACTC2l7rpoCGATCTGCTCAAGGGCAAGCCAGGATGTTGTTGGAGGACA495rpoC4GAGCTATTCGGCCACAGCGTCGAGGATCTCCTTCTTGC299inhAAGAAAGGGATCCGTCATGGTGTCACATTCGACGCCAAAC342r...