注：www.100biotech.comwww.100biotech.comwww.100biotech.comwww.100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.com鸡马立克氏病诊断技术规程1范围本标准规定了鸡马立克氏病(MD)的临床症状与病理变化、实验室诊断和综合判定。本标准适用于辽宁省境内的一切从事鸡类饲养、经营和鸡类产品生产、经营以及从事动物防疫活动的单位和个人对鸡马立克氏病的诊断、疫病监测及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB／T18643-2002鸡马立克氏病诊断技术标准SN／T1454-2004鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法NT/T905-2004鸡马立克氏病强毒感染诊断技术3临床症状与病理变化3.1临床症状3.1.1神经型病鸡步态不稳，发生不全或完全麻痹，不能站立，蹲伏地上，并且两腿前后伸展呈“劈叉”姿势。3.1.2皮肤型病鸡多在颈部、翅膀和大腿外侧体表毛囊腔形成结节及小的肿瘤状物。3.1.3眼型病鸡一侧或两侧眼睛失明，瞳孔边缘不整齐呈锯齿状，虹彩消失，眼球如鱼眼，呈灰白色。3.1.4内脏型病鸡精神萎靡，呆顿，食欲下降，明显消瘦，常缩颈蹲在墙角下。羽毛松乱无光泽，皮肤苍白，排绿色稀便。3.2病理变化3.2.1神经型外周神经肿胀，呈半透明水肿样，色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为正常神经的2倍～3倍。这些变化多发生在腰荐神经丛、坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位。3.2.2皮肤型注：www.100biotech.comwww.100biotech.comwww.100biotech.comwww.100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.com以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕色痂皮。3.2.3眼型虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；瞳孔不规则，有时偏向虹膜一侧。3.2.4内脏型以内脏出现肿瘤为特征，其中肝脏、腺胃的发生率最高。3.3病理组织学变化3.3.1采集病鸡肿胀的外周神经和内脏的肿瘤组织样品，按常规方法制备石蜡切片、苏木素伊红(HE)染色。通过普通光学显微镜进行病理组织学观察判定。3.3.2根据病变组织中浸润细胞的种类及形态学，外周神经病理组织学变化可分为A、B、C三个型。在同一只鸡的不同神经会出现不同的病变型。A型病变表现为淋巴母细胞，大、中、小淋巴细胞及巨噬细胞的增生浸润。B型病变表现神经水肿，神经纤维被水肿液分离，水肿液中多为小淋巴细胞、浆细胞和许旺氏细胞增生。C型病变为水肿和轻度小淋巴细胞增生。3.3.3内脏和其他组织的肿瘤与A型神经病变相似，为大小各异的淋巴细胞增生。4实验室诊断4.1病毒分离与鉴定操作方法按SN／T1454-2004执行。4.2琼脂扩散试验检测技术操作方法按GB／T18643-2002；NT/905-2004执行。4.3聚合酶链式反应试验4.3.1材料4.3.1.1样品的采集与处理无菌采集病鸡的全血、皮肤、皮屑、脾等内脏器官，在4℃～8℃尽快送往检测单位。在无菌室内将样品充分研磨，并加入0.04mol/LPBS(ph7.4)制成1：5悬液，3000r/min离心10min，取上清备用。阳性对照可选用马立克活疫苗。4.3.1.2试剂及引物TaqDNA聚合酶，dNTP，DL2000DNAMarker，琼脂糖，核酸提取试剂DNAzol，无水乙醇，ddH2O，75%乙醇。引物为上游5'TGCGATGAAAGTGCTATGGAGG3'；下游5'GAGAATCCCTATGAGAAAGCGC3'。目的片段大小为185bp、317bp或449bp中的一个或二个或三个目的片段。4.3.2方法4.3.2.1样品DNA的提取阳性对照与样品同时提取DNA，实验应使用ddH2O水作为阴性对照。注：www.100biotech.comwww.100biotech.comwww.100biotech.comwww.100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.comservice@100biotech.coma）取处理好的样品200μL加入1.5mL离心管中，加入800μLDNAzol病毒裂解液，颠倒混匀，室温放置3min。b）10000r/min离心10min。c）上清转移至另一离心管内，加500μL无水乙醇，混匀，室温放置3min。d）10000r/min离心5min。e）弃上清，加1mL75%乙醇，10000r/min离心5min。f）重...
