实验六细胞核和线粒体的荧光观察实验六细胞核和线粒体的荧光观察一、实验目的学习荧光显微镜的工作原理及使用方法了解荧光探针Rhodamine123和Hoechst33342与细胞成分的结合特性和光谱特性二、实验原理1.荧光显微镜细胞参量荧光探针吸收/发射nm特性DNA和RNAPropidumiodide(PI)535/617红色荧光嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于染色体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究Ethidiumbromide(EB)518/605红色荧光嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳分析,染色体观察DAPI358/461蓝色荧光半通透细胞,结合于DNA的AT碱基对.用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察Hoechst33342350/461蓝色荧光结合于DNA的AT碱基对,可进入活细胞,用于细胞周期的研究,染色体和细胞核的观察蛋白和抗体的耦联探针FITC494/518绿色荧光染死细胞,对PH值变化不敏感Texasred595/615红色荧光多参量细胞标记溶酶体Neutralred541/640红色荧光探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细胞器线粒体Rhodamine123507/529黄绿色荧光可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭快,无毒性常用荧光探针介绍Hoechst33342和Rhodamine123Ho.33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。荧光激发和发射特性分别为350nm和461nm。罗丹明123是一种亲脂性的阳离子荧光探针。用它来标记线粒体是由于线粒体的基质对于膜间隙具有负电荷，而罗丹明123具有正电荷，二者电性相吸。所以能较好地观察线粒体的形态变化。荧光激发和发射特性为507nm和529nm。三、仪器、材料与试剂三、仪器、材料与试剂仪器荧光显微镜，倒置显微镜材料A549、WI-38pc-3、载玻片，盖片，滴管，滤纸试剂PBS缓冲液pH7.4Ho.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS)罗丹明123储存液:1mg/mL(溶于甲醇)四、实验步骤四、实验步骤1.1.将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上2.2.配制配制Ho.33342Ho.33342和罗丹明和罗丹明123123工作液工作液:Ho.33342(1:Ho.33342(10μg/mL),0μg/mL),罗丹明罗丹明123(10μg/mL)123(10μg/mL)（溶于（溶于PBSPBS缓冲液，缓冲液，pH7.4pH7.4））3.3.将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次4.在parafilm膜上分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，将盖玻片上的细胞倒扣在parafilm膜上室温暗处孵育10min。5.在parafilm膜上加PBS缓冲液，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片,用PBS缓冲液轻轻漂洗2次。6.利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体。配制Ho.33342和罗丹明123工作液:Ho.33342(10μg/mL),罗丹明123(10μg/mL)（溶于PBS缓冲液，pH7.4）将盖玻片上的细胞用PBS缓冲液轻轻漂洗2次，分别滴加Ho.33342和罗丹明123工作液各10L，室温暗处孵育10min用PBS缓冲液轻轻漂洗2次，放在载玻片上制成的小室上利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体实验步骤实验步骤将肿瘤细胞和正常组织细胞培养到小盖玻片上,至细胞进入对数生长期思考题思考题1.荧光显微镜的工作原理，及使用时应注意的问题。2.细胞核的形态的变化与功能的关系
