乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定VIP免费

收稿日期:2011－05－24基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:81070077);省部共建重点教育部心血管重塑相关疾病重点实验室项目(编号:110267);首都医科大学基础－临床合作基金重点项目(编号:11JL09)作者简介:辛毅(1968－)，女，北京市人，学士，主管技师，主要从事细胞生物学研究。通讯作者:李温斌(1965－)，男，河南焦作人，博士，主任医师，博士生导师，主要从事心脏外科的基础与临床研究欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁欁氉氉氉氉。本文引用:辛毅，许秀芳，黄益民，等．乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定［J］．新乡医学院学报，2011，28(5):541-547．乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离培养及荧光鉴定辛毅1，许秀芳2，黄益民2，张颖1，李温斌3(1．首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所实验中心，北京100029;2．首都医科大学附属北京安贞医院北京市心肺血管疾病研究所分子生物学研究室，北京100029;3．首都医科大学附属北京安贞医院心外科，北京100029)摘要:目的探讨和建立适用于乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞体外分离、培养及鉴定的技术方法。方法乳小鼠心脏剪成组织块，用Ⅱ型胶原酶加胰蛋白酶联合消化法分离细胞，再通过差速贴壁分离法分别收集、培养乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞。光学显微镜下分别观察成纤维细胞和心肌细胞的基本形态特征的变化，并对2种细胞行苏木素-伊红(HE)染色，用第2代心肌成纤维细胞行波形蛋白免疫荧光鉴定，而原代心肌细胞行α-横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白和心肌肌球蛋白重链免疫荧光鉴定。结果差速贴壁分离法心肌成纤维细胞原代培养90min基本贴壁，贴壁较早，培养第3～5代细胞生长良好，72h心肌成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定纯度高达97%;而心肌细胞贴壁较晚，24h贴壁后部分心肌细胞出现自发性搏动现象，48h后细胞逐渐展开，72h后逐渐形成细胞簇并出现同步搏动，心肌肌球蛋白重链、心肌横纹肌肌动蛋白、心肌肌钙蛋白免疫荧光鉴定心肌细胞纯度分别为95%、93%、95%。结论差速贴壁分离法结合免疫荧光鉴定可分离乳小鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞，此方法成熟、稳定、有效，为研究心脏疾病的基础与临床研究提供了理想的实验模型。关键词:心肌成纤维细胞;心肌细胞;原代培养;乳小鼠;免疫荧光中图分类号:Q95-33;Q2-33文献标志码:A文章编号:1004-7239(2011)05-0541-07Isolation，primarycultureandidentificationofcardiacfibroblastsandcardiacmyocytesofneonatalmouseXINYi1，XUXiu-fang2，HUANGYi-min2，ZHANGYing1，LIWen-bin3(1．BeijingAnzhenHospital，CapitalMedicalUniversity，DepartmentofExperimentalCenter，BeijingInstituteofHeart，LungandBloodVesselDiseases，Beijing100029，China;2．BeijingAnzhenHospital，CapitalMedicalUniversity，DepartmentofMolecularBiology，BeijingInstituteofHeart，LungandBloodVesselDiseases，Beijing100029，China;3．DepartmentofCardiacSurgery，BeijingAnzhenHospital，AffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing100029，China)Abstract:ObjectiveTobuildtheisolation，cultureandidentificationtechniquesofcardiacfibroblastsandcardiacmyocytesofneonatemouse．MethodsTheheartofneonatemousewascutintopieces，thentypeⅡcollagenaseplustrypsi-nasedigestionmethodwereusedforisolatingcellandthencardiacfibroblastsandcardiacmyocyteswerecollectedandculturedbydifferentspeedadherence．Thebasicshapechangeofcardiacfibroblastsandcardiacmyocyteswereobservedundertheopit-icalmicroscopeandthetwokindscellsweregivenhematoxylin-eosinstaining．Thesecondgenerationcardiacfibroblastswereassayedbyvimentinimmunofluorescenceandcardiacmyocyteswereassayedbyα-sarcomeric-actin，cardiactroponinandcardi-acmyoglobulinheavychainimmunofluorescence．ResultsFibro...