实验十三 质粒DNA的转化(2012LB)VIP免费

实验十三实验十三质粒质粒DNADNA的转化的转化转化转化::将外源将外源DNADNA分子导入到受体细胞分子导入到受体细胞((宿主细胞宿主细胞))，使之获得新的遗传特性的过程，使之获得新的遗传特性的过程实验原理实验原理宿主细胞：宿主细胞：大肠杆菌(E.coli)DH5DH5菌株菌株感受态：感受态：细胞处于容易吸收外源DNA的状态质粒：质粒：是存在于细菌染色体以外的小型环状双小型环状双链链DNADNA，能自主复制自主复制和表达其携带的遗传信息EcoEcoRIRIEcoEcoRIRIpBS-Bcl-2pBS-Bcl-2重组质粒重组质粒(4861bp)(4861bp)图谱图谱Bcl-2Bcl-2MCSAmpAmprr：：内酰氨内酰氨酶基因酶基因质粒的转化原理质粒的转化原理将对数生长期的细菌置于将对数生长期的细菌置于0℃0℃、、CaCaClCl22低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形((感受态感受态细胞细胞))；；外源外源DNADNA分子在此条件下与分子在此条件下与CaCa2+2+结合形成抗结合形成抗DNADNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面；附在细菌表面；经经42℃42℃短暂热激短暂热激处理，使细胞膜通处理，使细胞膜通透性增大，促进细胞吸收透性增大，促进细胞吸收DNADNA复合物。复合物。单菌落单菌落((克隆克隆))工程菌的筛选工程菌的筛选含含AmpAmp的选的选择性培养基择性培养基已转化已转化的细菌(工程菌工程菌)能在含AAmpmp的选择性培养基上生长并形成菌落的选择性培养基上生长并形成菌落((克克隆隆))，而未转化的细菌则不能生长，而未转化的细菌则不能生长培养皿实验流程实验流程20ul20ul感受态细胞感受态细胞+5ul+5ul重组质粒重组质粒轻轻旋转混合轻轻旋转混合3737,50r/min℃,50r/min℃振振摇摇10min10min冰上放置冰上放置20min20min取取100ul100ul涂布于含涂布于含AmpAmp培培养基养基42,℃42,℃热激热激90s90s室温放置使液体吸收室温放置使液体吸收冰浴冰浴2min37℃2min37℃倒置培养倒置培养12~1612~16hh加加100ulLB100ulLB培养基培养基注意事项注意事项1.1.感受态感受态DH5αDH5α细菌很脆弱，加入细菌很脆弱，加入Bcl-2Bcl-2重组质重组质粒粒5μl5μl后，要轻轻旋转混合，后，要轻轻旋转混合，禁止剧烈振禁止剧烈振摇摇或吹打或吹打。。2.42℃2.42℃水浴水浴9090秒，时间和温度要准确，秒，时间和温度要准确，中途中途不能摇动离心管不能摇动离心管。。注意事项注意事项3.无菌操作要严格，防止外界细菌污染。无菌操作要严格，防止外界细菌污染。4.4.细菌铺板密度不能过高，倒置培养时间不细菌铺板密度不能过高，倒置培养时间不能过长能过长（（1212～～16h16h内内））。。思考题思考题转化实验中在含转化实验中在含AmpAmp的选择的选择性培养基上性培养基上实验组出现菌落实验组出现菌落，，但但阴性对阴性对照也有菌落出现照也有菌落出现，说明了什么？请分析，说明了什么？请分析原因。原因。