食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立VIP免费

2008,Vol.29,No.10食品科学※分析检测500食品中五种致病性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立邵碧英1，王传得2，郑晶1，黄晓蓉1,*，曹际娟3，陈彬1，吴谦1(1.福建出入境检验检疫局，福建福州350001；2.福建农林大学动物科学院，福建福州350002；3.辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连116001)摘要：采用试剂盒法提取5种致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌和拟态弧菌)的基因组DNA。分别合成5对特异性引物，对PCR反应体系进行优化后，建立了5种致病性弧菌间的MPCR-DHPLC检测方法。二重PCR-DHPLC检测灵敏度可达到100CFU/ml。建立的MPCR-DHPLC方法在食品中弧菌的检测上具有很好的应用价值。关键词：弧菌；基因组DNA；多重PCR；变性高效液相色谱DevelopmentofMPCR-DHPLCDetectionMethodforFivePathogenicVibriosinFoodsSHAOBi-ying1，WANGChuan-de2，ZHENGJing1，HUANGXiao-rong1,*，CaoJi-juan3，CHENBin1，WUQian1(1.FujianEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Fuzhou350001,China；2.CollegeofAnimalScience，FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China；3.LiaoningEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Dalian116001,China)Abstract：ThegenomeDNAsoffivepathogenicVibrioswereextractedbykitmethod,includingVibriocholerae,V.parahaemolyticus,V.vulnificus,V.alginolyticusandV.mimicus,andtheirfivepairsofspecialprimerswerecomposed,respectively.TheMPCR-DHPLCdetectionmethodsamongthefivevibriosweredevelopedafterthePCRreactionsystemswereoptimized.ThedetectionsensitivityofduplexPCR-DHPLCis100CFU/ml.ThedevelopedMPCR-DHPLCmethodhasgoodapplicationmeritondetectingtheVibriosinfoods.Keywords：Vibrio；genomeDNA；multiplexPCR(MPCR)；denaturalizationhighperformanceliquidchromatography(DHPLC)中图分类号：Q93-332文献标识码：A文章编号：1002-6630(2008)10-0500-05收稿日期：2008-06-27基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAK02A13-11)作者简介：邵碧英(1973-)，女，高级工程师，博士，研究方向为食品微生物检验。E-mail：byshao@yahoo.com*通讯作者：黄晓蓉(1958-)，女，主任技师，研究方向为食品微生物检验。E-mail：hxrwz@vip.sohu.com霍乱弧菌(Vibriocholerae)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)和拟态弧菌(V.mimicus)是食品中常见致病性弧菌，也是进出口食品中要求检测的常见的微生物项目。聚合酶链反应(PCR)具有传统微生物检验方法无与伦比的优点，如快速、灵敏，已广泛应用于致病菌的检测。近年来，在PCR基础上发展的多重PCR(multiplexPCR，MPCR)技术，在一个反应体系中可同时检测多个目的片段，可节约成本、提高检测效率，在致病性弧菌检测上的应用已有一些报道[1-5]，但都是采用凝胶电泳的方法来检测MPCR产物，步骤多，且要接触潜在的致癌物质——溴化乙锭。变性高效液相色谱技术(DHPLC)是一种新近发展的先进技术，可用于PCR、MPCR产物的快速分析。本实验选取5种主要的致病性弧菌(副溶血性弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌)为研究对象，拟建立这5种弧菌间MPCR-DHPLC检测方法，并用于日常送检样品的检测。1材料与方法1.1菌株霍乱弧菌本实验室保存；副溶血性弧菌标准菌株ATCC178上海汉尼公司；拟态弧菌(1.1969)、溶藻弧菌501※分析检测食品科学2008,Vol.29,No.10表15种弧菌的引物Table1Primersfor5Virbios弧菌扩增基因引物名称序列(5→3)产物大小(bp)副溶血弧菌(V.p)不耐热溶血毒素基因TLH-FAAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG450TLH-RGCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC溶藻弧菌(V.a)胶原酶基因VAC-FCTTATGGGACTTCGGTGATGGCT210VAC-RCGCCCACCGCTTACTTTACTTTG创伤弧菌(V.v)溶细胞素基因VVHA-FTTGGTCCATTCGCCAGCAGTTAC582VVHA-RTGTTGGTTGACGAGCCCGCAGAG霍乱弧菌(V.c)胶原酶基因VCC-FCCTAATGAGCAACCGACTATCAAAGA155VCC-RTGTTCTGAAGCGGTGAGCCATAC拟态弧菌(V.m)溶血素基因VMH-FAAGGGAAAGTGAATCAGCAGCGAGTA243VMH-RCGACCATTTGTTGACGCCCATCT''(1.1833)标...