第35讲基因工程[考纲明细]1.基因工程的诞生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3.基因工程的应用(Ⅱ)4.蛋白质工程(Ⅰ)实验：DNA的粗提取与鉴定板块一知识·自主梳理一、基因工程的概念及基本工具1．基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。2．DNA重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。③结果：产生黏性末端或平末端。例：如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是—GAATTC—，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是—CCCGGG—，切割位点在G和C之间；说明限制酶具有专一性。④本质：蛋白质。(2)DNA连接酶①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。②类型③DNA连接酶和限制酶的关系(3)载体①载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。②常用载体：质粒。其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。③质粒a．概念：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。b．特点：能自我复制；有一个至多个限制酶切位点；有特殊标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取(1)从基因文库中获取①前提条件：目的基因序列未知。②基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，可分为基因组文库和部分基因文库(如cDNA文库)。③构建过程(2)利用PCR技术扩增目的基因①PCR含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②PCR原理：DNA双链复制。③前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。④要求模板：目的基因两条链。原料：四种脱氧核苷酸。酶：热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。引物：人工合成的两条DNA片段(引物1，引物2)。⑤PCR反应过程⑥方式：指数形式扩增(2n，n为扩增循环的次数)。⑦结果：短时间内大量扩增目的基因。(3)人工合成①前提条件：核苷酸序列已知，基因比较小。②方法a．反转录法：目的基因的mRNA――→单链DNA――→双链DNA(目的基因)b．化学合成法：蛋白质的氨基酸序列――→mRNA的核苷酸序列――→目的基因的核苷酸序列――→目的基因2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)操作目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)组成(3)构建过程3．将目的基因导入受体细胞(1)目的基因导入植物细胞①农杆菌转化法：最常用的方法。a．受体细胞：植物体细胞或受精卵。b．操作过程：将目的基因插入Ti质粒的TDNA上―→转入农杆菌―→导入植物细胞―→TDNA上的目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上―→目的基因表达。②基因枪法：适用于单子叶植物，成本较高。③花粉管通道法：将目的基因通过花粉管通道导入受体细胞，十分简便经济。(2)目的基因导入动物细胞①方法：显微注射技术。②受体细胞：动物的受精卵。③操作过程：将含有目的基因的表达载体提纯―→取卵(受精卵)―→显微注射―→受精卵经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内―→获得具有新性状的动物。(3)目的基因导入微生物细胞①转化方法a．用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。b．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。②受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌)。③原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。4．目的基因的检测与鉴定(1)不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。(2)在DNA分子、mRNA分子上检测目的基因是否插入、目的基因是否转录时，用的探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段。三、基因工程的应用1...
