应用昆虫学报ChineseJournalofAppliedEntomology2013，50(2):293－297．DOI:10．7679/j．issn．2095－1353．2013．039线粒体基因组测序策略和方法*沙淼林立亮李雪娟黄原＊＊(陕西师范大学生命科学学院西安710062)摘要本文综述了线粒体基因组测序策略和方法，在传统测序方法中介绍了基于物理分离线粒体DNA的克隆文库测序方法和基于PCＲ扩增产物的直接测序方法，后者重点介绍了基于长PCＲ扩增产物的引物步移法和基于总DNA的引物步移法;应用新一代高通量测序方法有基于总DNA样品的方法，包括需要预扩增mtDNA的多物种平行高通量和无需预扩增mtDNA的高通量方法，基于总ＲNA样品的转录组测序方法等。在实际工作中，选择哪种方法取决于研究规模、样品大小和保存状态、经费情况等。总的来说，基于长PCＲ扩增产物的引物步移法尤其适合小规模昆虫线粒体基因组研究，而对于大规模线粒体基因组研究来说，NGS技术无疑是省时省力的最佳选择。关键词线粒体基因组，长PCＲ，引物步移法，高通量测序StrategyandmethodsforsequencingmitochondrialgenomeSHAMiaoLINLi-LiangLIXue-JuanHUANGYuan＊＊(CollegeofLifeScience，ShaanxiNormalUniversity，Xi’an710062，China)AbstractThispaperreviewsstrategyandmethodsforsequencingmitochondrialgenomes．Twotraditionalsequencingmethodsareintroduced;theclonelibrary-basedsequencingmethodfromphysicallypurifiedmtDNA，andthePCＲamplicon-basedsequencingmethod，whichincludesprimer-walkingsequencingfromlongPCＲampliconsandprimer-walkingsequencingfromtotalDNA．Fortheapplicationofnext-generationsequencingstrategies，therearetotalDNA-basedmethods，whichincludetheparalleltaggedsequencing(PTS)methodbasedonpre-amplifyingmtDNAandtotalDNA，andthetranscriptomicsequencingmethodbasedontotalＲNA．Fromapracticalperspective，whichmethodischosendependsonthescaleoftheresearch，sizeandpreservativestatusofthesample，andfinancialsupport．Theprimerwalkingsequencingmethodbasedonlong-PCＲampliconsisparticularlysuitableforsmallscaleresearchoninsectmitochondrialgenomes．Forlargescalemitochondrialgenomeresearch，NGStechnologyisthebestchoiceforsavingtimeandeffort．Keywordsmitochondrialgenome，long-PCＲ，primer-walking，next-generationsequencing*资助项目:国家自然科学基金(31172076，30970346)。＊＊通讯作者，E-mail:yuanh@snnu．edu．cn收稿日期:2013-01-01，接受日期:2013-01-101前言线粒体基因组作为研究DNA复制和转录的良好模型，同时也是遗传和进化上广泛使用的分子标记，近年来被广泛应用于生物学的许多领域。后生动物线粒体基因组大小一般在16～17kb之间，编码13个蛋白质基因，2个rＲNA基因和22个tＲNA基因。自从第一个线粒体基因组(人类mtDNA)序列1981年被测定以来，截止2012年12月底在NCBI基因组数据库中登记的线粒体全基因组序列的后生动物有2924种，其中昆虫346种。线粒体基因组的研究方法在近几十年中不断发展，尤其最近高通量测序技术的出现，为线粒体全基因组测序提供了新的策略。本文对目前常用的传统和高通量线粒体基因组测序策略和方法进行了综述。·294·应用昆虫学报ChineseJournalofAppliedEntomology50卷2传统线粒体基因组测序方法传统线粒体基因组测序技术主要是基于克隆文库或PCＲ扩增产物的Sanger测序方法，其中基于PCＲ扩增产物的引物步移法仍然是目前小规模线粒体基因组研究的主流方法。2.1基于物理分离线粒体DNA的克隆文库测序方法物理分离mtDNA是通过氯化铯密度梯度离心或差速离心法将细胞的不同组分分开获得纯度较高的mtDNA，然后再选用切割位点较少且分布较均匀的一种或几种核酸限制性内切酶对mtDNA进行部分或完全酶切，获得长度为数百碱基适合用于测序的短片段，或者利用不同强度的超声波将获得的mtDNA随机打断，形成不同长度的短片段，然后将其克隆到质粒载体中进行测序(TamuraandAotsuka，1988)。早期应用这种方法较多，如Tzeng等(1992)利用氯化铯密度梯度离心...
