原核表达步骤VIP专享VIP免费

实验方法与步骤1表达质粒的构建及测序分析1.1cofilin-1的片段的准备1.1.1引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用PrimerPremier5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR引物。引物如下：引物名称序列F-cofilin-15′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-15′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。1.1.2cofilin-1片段PCR1反应体系：KODpolymerase(3’-5’核酸外切酶活性)2.5μlKODpolymerasebuffer5μlMgSO42.5μlDMSO（“万能溶剂”）2.5μldNTPMixture5μlPrimerF（底物）1.5μlPrimerR1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O25μlTotal50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤goto②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μlEB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μlMarker、50μl样品＋10μlloadingbuffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。4割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用OmegaBio-Tek公司的GelExtrectionKit进行回收：（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的bindingbuffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。（3）将HibindDNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至HibindDNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。（4）将柱子装回收集管中，加入300μlbindingbuffer，10000×g离心1min，弃滤液。（5）将柱子装回收集管中，加入700μlSPWwashbuffer，10000×g离心1min，弃滤液。（6）重复步骤（5）一次。（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000×g离心2min，洗脱DNA。1.2表达载体pET-28a质粒的抽提接种含pET-28a的大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。质粒抽提采用OmegaBio-Tek公司的PlasmidMiniKitI进行质粒小抽：1取－20℃冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5α菌种50μl接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养12h。划平板，活化菌种，置于37℃恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37℃，180rpm培养12h。2加入200μlGPSbuffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000×g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。3将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000×g离心1min，彻底去除上清，收集沉淀菌体。4加入200μlSolutionI/RNaseA混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。5往重悬液中加入200μlSolutionⅡ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。6加入300μlSolutionⅢ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。室温下，10000×g离心10min。7取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。室温下，10000×g离心1min，弃滤液。8将柱子装回收集管中，加入500μlHiBindbuffer。室温下，10000×g离心1min，弃滤液。9将柱子装回收集管中，加入700μlWashSolution。室温下...