实验六双相免疫扩散试验一．实验目的1.复习巩固免疫化学的基本知识。2.熟练掌握免疫扩散法的操作步骤。二．实验原理抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周凝胶中扩散，当二者发生特异性反应时，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原，抗体的特异性和浓度，而且与其分子的大小及扩散速度有关，当抗原体存在多种成分时，将呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用范围较广。本实验用于检测免疫成功与否及所产生的抗体的效价，抗体效价以出现明显沉淀线时的抗体的最高稀释度为判定终点。一般来说，当效价≥1:16时（可在1:64以上），即可放血收集血清。三．实验用品1.待测血清（抗体）。2.0.4%BSA（抗原）。3.琼脂粉、生理盐水。4.载玻片、吸管、滴管、打孔器、湿盒等。四．实验操作1.制备琼脂凝胶：生理盐水配制浓度为12g/L的琼脂，完全溶化至澄清。2.浇板：将载玻片置于水平台上，吸取琼脂加在玻片上，盖满、平整、无气泡3.打孔：待琼脂凝固后，按下图打孔。图1打孔示意图4.加样：中心孔加入抗原，1-6孔所加血清的稀释度分别为：1:1，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，每孔加样10μl。5.扩散：将加好样的琼脂板放入湿盒中，室温放置1-3d观察结果。五．实验结果24h后肉眼观察可见只在1号孔和中心孔之间产生了乳白色沉淀线，其它孔都之间都未出现沉淀线。图2扩散结果示意图六．分析讨论1．本次实验出现了沉淀线，但是只有1号孔和中心孔之间产生了乳白色沉淀线，其它孔都之间都未出现沉淀线，说明免疫成功，但所产生抗体的效价≥1:1且＜1:8，抗体效价过低，需加强免疫再做鉴定才能作后续实验。2.本次实验中的反应为沉淀反应，虽然发生机制与凝集反应基本相同，但是沉淀反应的沉淀原分子小，单位体积内总面积大，故在定量试验时，通常稀释抗原。3．注意事项：①用琼脂浇载玻片时，载玻片必须保持水平位置。打孔时不要将琼脂打穿。②每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。③反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假阴性，时间过短，则沉淀线不出现或不清楚。④试验前应做预试验，初步确定抗体的稀释度。
