免疫组化操作步骤VIP免费

免疫组化操作步骤第一节免疫组化操作步骤及抗原修复（供参考）第二节免疫组化抗原热修复的技术要点（供参考）（一）、仪器设备1.18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1.PBS缓冲液（pH7.2―7.4）2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）3.3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制4.风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合b油和TBS(PBS)配制5．TBS/PBSpH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;pH7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。a组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b无水乙醇中浸泡五分钟c95%乙醇中浸泡五分钟d75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：抗原修复（免疫组化石蜡切片）用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构，蛋白多肽发生交联，导致部分抗原表位封闭，结合位点减少，所以需要抗原修复，以暴露原来的抗原表位，达到充分显露抗原，以不出现明显脱片现象为佳。抗原修复的几种常用方法（供参考）1.微波炉加热：在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟，再温火沸腾3分钟即可。适用的抗原：来源于人、大鼠、小鼠的组织标本；来源于其他动物种属的组织标本：2.沸热修复：电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。3.高压热修复：在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。（骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复）4.酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP.Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等石蜡切片免疫组化染色步骤1.三步法（以SP试剂盒为例）●石蜡切片脱蜡至水。●蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如果采用抗原修复，可在此步后进行。●3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。●5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。●PBS冲洗，2分钟×3次。●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。●PBS冲洗，2分钟×3次。●滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。●PBS冲洗，2分钟×3次。●显色剂显色（DAB或AEC）。●自来水充分冲洗，复染，脱水透明、封片。●如果必要，可选用avdin封闭内源性生物素。2.SABC法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2次各5分钟（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5）PBS洗5分钟（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃20分钟（10）PBS洗3次各2分钟（11）滴加试剂SABC20℃-30℃20分钟（12）PBS洗4次各5分钟（13）DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检。冰冻切片的免疫组化染色步骤●速冻组织●冰冻切片4~8μm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。●室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其他的固定方式。●PBS冲洗，5分钟×3次。●用3%过氧化氢孵育5...