实验四细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检查中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的办法称为分离；纯培养是指一株菌种或一种培养物中全部的细菌都是由一种细胞分裂、繁殖而产生的后裔。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。目的规定1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。2．理解细菌的菌落形态及其在多个培养基上的培养性状。3．理解培养性状对细菌鉴别的重要意义。4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。操作环节一．需氧性细菌分离培养法1.平板划线分离法菌种被其它杂菌污染时或混合菌悬液惯用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向持续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达成纯化目的。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充足冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，普通培养基不适宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离重要有持续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。划线法示意图见图4-3。（1）持续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边沿一处，取出接种环，烧去多出菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边沿空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充足运用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。(2)分区划线法（四分区划线法）取菌、接种、培养办法与“持续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的重要分布区，故其划线面积应最大。为避免第4区内划线与1、2、3区线条相接图4-1持续划线法图4-2分区划线法图4-3划线分离示意图触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最佳保持120度左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70度。灼烧接种环，待在平板边沿上冷却后，再按以上办法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70度，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37℃恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。2.倾注平皿分离法被检材料若含有两种或两种以上细菌时,可借助溶化的琼脂将细菌稀释，待琼脂冷凝后,分散的细菌就被固定在原地形成菌落.这样也能达成分得纯种的目的。根据材料中存在菌数的多少，倾注平皿前可将被检材料不稀释或用生理盐水作适宜稀释。其具体办法以下：取三支预先准备的普通琼脂培养基试管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第一管内，充足摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样办法自第二管移种至第三管。然后分别倾注一种已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。成果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，普通第一种平板内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐步减少，可见单个菌落。3.芽胞需氧菌分离培养法如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而生长繁殖，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。4．运用化学药品的分离培养法（1）抑菌作用有些药品对某些细菌有极强的克制作用，而对另外某些细菌没有克制作用，因此可运用这种特性进行细菌的分离，例如普通在培养基中加入结晶紫或青霉素等化...
