新一代测序技术（下）-SOLiD(ABI)摘要：454公司首推划时代的新一代测序仪，从而引发了测序市场上454、Illumina、ABI等公司在新一代测序技术上的比拼高潮。也正是这种你追我赶，让绘制人类全基因组图谱由过去的耗费亿美元和时间，骤然缩短到如今SOLiD3运行一次即获得50GB可定位测序数据。生物通6月重磅推出新一代测序技术专项，将逐个为你解析Illumina、ABI、Roche（454）的新一代测序仪，并聚集世界各大基因组中心诸多牛人对新一代测序仪的选择原则及使用反馈。敬请期待！过去，美国应用生物系统公司（ABI）在测序方面始终占据着垄断地位。自公司的共同创始人LeroyHood在上世纪80年代中期设计了第一台自动荧光测序仪之后，生命科学研究就摆脱了手工测序的繁琐和辛苦，骄傲地迈入自动测序的新时代。直到，454推出了FLX焦磷酸测序平台，ABI的领先地位开始有些动摇。之后，ABI快速收购了一家测序公司——AgencourtPersonalGenomics，并在底推出了SOLiD新一代测序平台。从SOLiD到如今的SOLiD3，短短一年多时间，它已经上演了一出精彩的“一级方程式赛车”。SOLiD全称为supportedoligoligationdetetion，它的独特之处在于以四色荧光标记寡核苷酸的持续连接合成为基础，取代了传统的聚合酶连接反映，可对单拷贝DNA片段进行大规模扩增和高通量并行测序。就通量而言，SOLiD3系统是革命性的，现在SOLiD3单次运行可产生50GB的序列数据，相称于17倍人类基因组覆盖度。而其无以伦比的精确性、系统可靠性和可扩展性更让它从其它新一代测序平台中脱颖而出。为什么SOLiD能轻松实现貌似不可能的任务？让生物通带你从测序原理入手，一探终究。SOLiD工作流程a.文库制备SOLiD系统能支持两种测序模板：片段文库(fragmentlibrary)或配对末端文库(mate-pairedlibrary)。使用哪一种文库取决于你的应用及需要的信息。片段文库就是将基因组DNA打断，两头加上接头，制成文库。如果你想要做转录组测序、RNA定量、miRNA探索、重测序、3’,5’-RACE、甲基化分析、ChIP测序等，就能够用它。如果你的应用是全基因组测序、SNP分析、构造重排/拷贝数，则需要用配对末端文库。配对末端文库是将基因组DNA打断后，与中间接头连接，再环化，然后用EcoP15酶切，使中间接头两端各有27bp的碱基，再加上两端的接头，形成文库。b.乳液PCR/微珠富集在微反映器中加入测序模板、PCR反映元件、微珠和引物，进行乳液PCR（EmulsionPCR）。PCR完毕之后，变性模板，富集带有延伸模板的微珠，去除多出的微珠。微珠上的模板通过3’修饰，能够与玻片共价结合。看到这里，是不是有一种似曾相识的感觉呢？那就对了，此环节与454的GSFLX基本相似。但是SOLiD系统的微珠要小得多，只有1um。乳液PCR最大的特点是能够形成数目庞大的独立反映空间以进行DNA扩增。其核心技术是“注水到油”，基本过程是在PCR反映前，将包含PCR全部反映成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反映空间。抱负状态下，每个小水滴只含一种DNA模板和一种P1磁珠，由于水相中的P2引物和磁珠表面的P1引物所介导的PCR反映，这个DNA模板的拷贝数量呈指数级增加，PCR反映结束后，P1磁珠表面就固定有拷贝数目巨大的同来源DNA模板扩增产物。c.微珠沉积3’修饰的微珠沉积在一块玻片上。在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域。SOLiD系统最大的优点就是每张玻片能容纳更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。d.连接测序这一步可就是SOLiD的独门秘笈了。它的独特之处在于没有采用惯常的聚合酶，而用了连接酶。SOLiD连接反映的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反映中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。探针的5’末端分别标记了CY5、TexasRed、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料。探针3’端1～5位为随机碱基，能够是ATCG四种碱基中的任何一种碱基，其中第1、2位构成的碱基对是表征探针染料类型的编码区，下图的双碱基编码矩阵规定了该编码区16种碱基对和4种探针颜色的对应关系，而3～5位的“n”表达随机碱基，6～8位的“z”指的是能够和任何碱基配对的...
