凝胶迁移实验（EMSA）实验方法凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA 互作研究。一、实验原理EMSA主要基于蛋白 -探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。二、实验操作步骤1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、 核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。（3）探针制备根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加， 部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。2、形成蛋白 -探针复合物（1）在 0.5ml 离心管中按顺序将下列组份混匀：蛋白样本（ 2-5μg）Xμ lpoly d(I-C) 1μ lBinding Buffer 2μ lNuclease-Free ddH2O Xμ l总体积9μ l（2）冰浴 5min 后，加入 1μ 探针。（对照组加 1ul 对照探针）（3）PCR仪中室温（ 20-23℃）温育 30min。3、制备凝胶，电泳（1）制备 6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶：（注意根据试剂情况按比例调整总体积）5XTBE 1ml 30%Acrylamide/Bis 2.2ml deionized,sterilewater 6.62ml 80%Glycerol 80μ l10%AP 90μ lTEMED 10μ l总体积10ml （2）按标准步骤制备凝胶。（3）加样前先在预冷的0.5X TBE buffer中 120V 预电泳 10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。（4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。（5）将电泳槽置于冰上或者4℃环境中，恒压 100V 进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm 为止。（大约 50-60min，根据实际情况调整电泳时间及电压；电泳时间不宜过长）4、转膜（1）在预冷的 0.5XTBE中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。（2） 按如...
