原核表达及抗体的制备重点讲义资料VIP免费

实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化细菌处于容易吸收外源DNA 的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在 0℃下的 CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA 形成不易被 DNA 酶所降解的羟基— 钙磷酸复合物， 此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理 （热休克），可以促进细胞吸收DNA 复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如 Amp 抗性 ) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上， 37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。感受态细胞的制备1．从大肠杆菌 DH5a 平板上挑取一个单菌落接于2mL LB 培养液的试管中， 37℃振荡培养过夜。2．取 50UL 菌液转接到一个含有5mL LB 培养液锥形瓶中， 37℃振荡培养 2 小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行：3．用灭菌的枪头取 0.5mL 的大肠杆菌培养物于1.5mL 灭菌离心管中，冰上放置3 分钟后，加入 0.5mL 预冷的 Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意： 1mL 的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。4．将上述细胞分装于 1.5mL 离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管 0.1mL。细胞可以立即使用或储存。5．将感受态细胞迅速转移到 -20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高， 解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。转化 ：1．新鲜制备的或 -20℃下保存的感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。2．取 200UL 的感受态细胞，加入适量的重组子，轻轻混匀. 3.冰浴 30min. 4．42℃水浴热激 90 秒。5．冰上放置 2-5 分钟。6．加 400UL LB 培养液， 37℃ 振荡培养 45 分钟。7．将适量的菌液涂布在Amp/LB （Amp50ug/ml ）琼脂平板上。9．平皿在 37℃下正向放置 1 小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。[实验结果 ]经 37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB 琼脂平板上出现的菌落即为pUC19 质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每 mg 质粒 DNA 转化的菌落数表示。实验二 质粒 DNA 的提取[实验原理 ] 碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA 与线状的染色体DNA 片段在拓扑学上的差异来分离它们...