海南大学农学院09 级生物科学专业许连华 20090110310061 人口腔上皮细胞提取基因组DNA及 PCR-RFLP法鉴定 CYP2C9基因一实验目的1、练习酚 - 氯仿法提取人的基因组DNA 2、掌握 PCR法分离全基因组中特定基因的原理和方法3、熟悉 RPLF法鉴定遗传多态性并掌握其鉴定基因型的原理二实验原理 1 、酚- 氯仿法抽提基因组DNA的原理在 EDTA存在下，用蛋白酶K 消化细胞，用去垢剂溶解细胞膜，用酚抽提，除去杂蛋白、 RNA及其他大分子，用异丙醇或乙醇沉淀可得到口腔上皮基因组DNA。 2 、PCR法分离基因的原理 PCR即聚合酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在带扩增的 DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，DNA聚合酶以单链DNA为模板利用反应体系中的dNTP,按 5′ →3′ 方向经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n。3、RFLP的原理 RFLP即限制性内切酶片段多态性是基因型之间限制性片段长度的差异，是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变引起的。 CYP2C9是细胞色素 P450超家族的成员之一。是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，催化多种内外物质的代谢。 目前约有 16%的临床药物由 CYP2C9负责代谢。CYP2C9具有高度的多态性。 T269C是位于 CYP2C9基因第二外显子的一个多态位点。中国人群中大多数是纯合子，可被EcoRⅡ内切，内切位点（CTC/A）GG387bp+302bp(GAC/T)CC;少数 CYP2C9产生突变。突变T269C，CCTGG突变为CTTGG，EcoRⅡ内切产生三条片段192bp+195bp+302bp。本实验利用RFLP酶切技术检测 CYP2C9的基因型。三实验器材与试剂 1 、器材 1.5ml离心管，系列移液枪，消毒棉签，恒温水浴锅，台式离心机，电泳系统，PCR仪2、试剂人口腔上皮细胞，裂解液（150mM EDTA PH8.0 950ul+10%SDS 50ul），酚 氯仿/ 异戊醇， 20mg/ml 蛋白酶 K，5M Nacl，70%乙醇，琼脂糖凝胶电泳系统，PCR扩增体系（水 10 ×buffer dNTP Mgcl2 PF P R Taq 酶 ），Marker，酶切体系（ 10×buffer Bci130I）。四实验步骤 1 、口腔上皮细胞基因组DNA提取①取 1.5ml 离心管，加入 1ml 裂解液（ 50mM EDTA PH8.0 950ul+10%SDS 50ul ）②取消毒棉签在漱口后的擦刮，放入1ml 裂解液中洗脱③加入 20mg/ml 蛋白酶 K2.5ul ，混匀， 56° C水浴 2h ④取新的 1.5mlEP 管加入 300ul 酚，300ul 氯仿/ 异戊醇（ 24:1 ）⑤取 800ul 上述裂解反应液加入④试剂中⑥颠倒混匀，...
