精品文档。1 欢迎下载基因定点突变全攻略一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。二、定点突变的原理定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。 定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/ 优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。 对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入， 可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构， 对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/ 结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（ wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍， 甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广， 比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者 DNA作用元件， 提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面。通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物， 在 PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp 。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12 个 bp 才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12 个 bp，并且合成多一条反向互补的引物。（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（ GC含量应大于40%）。（3）如果 Tm值低于 78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到 78℃（ GC含量应大于 40%）。（4）设计上下游引物时确保突变点在引...
