实时荧光定量PCR原理和试验VIP免费

实时荧光定量PCR 原理和实验所属分类 : 基因检测更多见www.infobio.org无论是对遗传病 (如地中海贫血和血友病)、传染病 (如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断， 还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR 技术都可以发挥很大作用。定量PCR 技术的最新进展是 实时荧光定量 。该技术借助于荧光信号来检测PCR 产物， 一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR 每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定 CT 值，从而根据 CT 值确定起始 DNA 拷贝数，做到了真正意义上的DNA 定量 。这是 DNA 定量技术的一次飞跃。根据最终得到的数据不同，定量PCR 可以 分为相对定量和绝对定量 两种。典型的 相对定量 如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同， 荧光定量 PCR又可以 分为 TaqMan 探针和 SYBR Green I 荧光染料 两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。 在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正， 以消除偶然误差。 因此重复实验和设立内对照非常重要。 由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。1 为什么终点定量不准确？我们都知道理论上PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的 PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S 形曲线。这是因为随着 PCR 循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至 DNA 模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低， 产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的 Taq 酶都被饱和以后， PCR 就进入了平台期。 由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA 拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图 1）。图 1 同一个样本重复96 次 PCR的扩增曲线传统的定量方法， 如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的...