中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则VIP专享VIP免费

中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则 《中国药典》2015 年版 本法用于中药材（包括药材及部分饮片）及基原物种的鉴定。 DNA 条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA 序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA 序列是由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）四种碱基以不同顺序排列组成，因此对某一特定DNA 片段序列进行分析即能够区分不同物种。 中药材DNA 条形码分子鉴定通常是以核糖体 DNA 第二内部转录间隔区（ITS2）为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系，其中植物类中药材选用ITS2/ITS 为主体序列，以叶绿体 psbA-trnH为辅助序列，动物类中药材采用细胞色素 C 氧化酶亚基I（COI）为主体序列，ITS2 为辅助序列。 一、仪器的一般要求 所用仪器有电子天平、离心机、聚合酶链式反应（poly merase chain reaction，PCR）仪、电泳仪和测序仪。 DNA 序列测定用测序仪，是一台具有自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA 片段中碱基顺序或大小，以及定量用精密仪器。测序方法主要采用双脱氧链终止法，又称 Sanger 法。4 种双脱氧核苷酸（ddNTP）的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管时，不同长度的DNA 片段上的4 种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被电荷耦合元件图像传感器（charge-cou pled dev ice，CCD）检测系统识别，并直接翻译成 DNA序列，获得供试品的峰图文件和序列文件。 二、测定步骤 本法主要包括供试品处理、DNA 提取、DNA 条形码序列 PCR 扩增、电泳检测和序列测定、序列拼接及结果判定，主要步骤如下。 1.供试品处理 按药材和饮片取样法（通则 0211）取样。为防止外源微生物污染，药材和饮片一般使用 75%乙醇擦拭表面后晾干，或采取其他有效去除微生物污染的方法。称取 10～100mg 备用。供试品具体取样部位根据不同药材特性作出相应规定。 2.D N A 提取 DNA 的提取包括使用研钵或研磨仪破碎细胞，粉碎成细粉，用试剂盒法进行 DNA 的分离和纯化等步骤，目前常用试剂盒包括植物基因组 DNA 提取试剂盒和动物组织/细胞基因组 DNA 提取试剂盒，实验选用的试剂盒须能够提取到满足后续实验要求的模板 DNA。 由于植物类中药材种类繁多，可根据所鉴定的中药材的具体情况对提取方法加以改进。例如：植物细胞内含有大量多糖、多酚等次生代...