免疫荧光技术陈海蓉一、一些基本概念和基本知识：1荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术2.技术分类：⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术)抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法⑵免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法3荧光的产生：物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质称为荧光素由光激发所引起的荧光，为光致荧光------荧光免疫技术由化学反应所引起的荧光，为化学荧光------化学发光技术4荧光素的荧光特性：⑴停止供能，荧光现象随即终止⑵对光的吸收和荧光的发射具高度选择性入射光波长<发射光波长⑶荧光效率：发射荧光的光量子数荧光效率=吸收光的光量子数⑷荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱5常见荧光素：⑴FITC⑵RB200⑶TRITC⑷镧系：Eu、Tb⑸PE⑹其它常见荧光素的特性：⑴FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光⑵RB200：橘红色粉末,吸收光570nm，发射光595~600nm，橘红色荧光⑶TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光620nm，橙红色荧光⑷镧系：Eu、Tb⑸PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红色荧光⑹其它：酶作用后产生荧光物质6合适荧光素的选择⑴具有与蛋白质形成共价键的化学基团荧光素-N=C+NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质‖︱‖︱︱SHHSH⑵荧光效率高，标记后下降不明显⑶荧光色泽与背景色泽对比鲜明⑷标记后能保持生物学活性和免疫活性⑸标记方法简单、快速⑹安全无毒7标本的固定：⑴固定目的•防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落•去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质•易于保存⑵常用的固定方法：抗原固定剂固定方法蛋白质95%乙醇室温3~10min或4℃30minIg类甲醇同上酶类丙酮同上激素CCl4同上类脂质10%福尔马林室温3~10min多糖(细菌)10%福尔马林室温3~10min或430min℃丙酮、甲醇病毒无水乙醇室温5~10min或430~60min℃丙酮、CCl4或-2060min℃以上二、试验类型1直接法2间接法3补体结合法4双标记法抗原标记抗体光源荧光直接法原理示意图间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光源荧光三、方法1.在35mm培养皿中接种细胞，至生长旺盛时，用甲醇直接固定5min2.加1mlPBST振荡洗涤3次，每次5min3.用1：100浓缩正常羊血清（2,000×g，离心5min）封闭非特异性位点30min4.加1mlPBST振荡洗涤3次，每次5min三、方法5.滴加1：500第一抗体5×10-4L（JWA多克隆抗体和单克隆抗体，2,000×g，离心5min），37℃于摇床湿盒中，孵育2h6.加1mlPBST振荡洗涤3次，每次5min7.滴加1：300第二抗体5×10-4L（FITC标记羊抗兔IgG和罗丹明标记的IgG(H+L)，2,000×g，离心5min），37℃于摇床湿盒中，孵育1h8.加1mlPBST振荡洗涤3次，每次5min三、方法9.小心切除培养皿侧边，注意其皿底的平整性，再用PBST缓冲液轻轻冲洗一下以确信洗去滞留在细胞面上的微小塑料屑，并于通风处晾干10.滴加阻止荧光淬灭剂Vectashield滴，并覆以酒精擦净晾干的盖玻片，遮光低温4℃保存11.于IX-70倒置荧光显微镜（奥林巴斯，日本）下用1,000×油镜观察，同时也可应用激光共聚焦显微镜进行观察并照相四、注意事项1.标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合2.荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定四、注意事项3.由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察4.保存的方法可采取以下几种：①固定标本片以后低温保存，随用随染；②染色片采取优质封固剂
