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VIGS技术研究进展汇报人：郭庆东1VIGS的概念2VIGS的原理4VIGS技术的应用3VIGS的优缺点VIGS一、VIGS的概念•病毒诱导的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS）是指携带目标基因片段的病毒侵染植物后，可诱导植物内源基因沉默、引起表型变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。二、VIGS的原理•VIGS是利用植物对病毒的天然防御机制发展的瞬时、快速鉴定植物基因功能的技术，是从基因序列到功能的反义遗传学方法，也是转录后基因沉默(Post-transcriptgenesilencing,PTGS)、RNA沉默机制的一种表现，相似于线虫的RNA干扰。•已在真菌、植物和动物的许多物种中发现了PTGS过程的同源基因和酶，因此认为PTGS机制在整个生物进化过程中是很保守的。目前关于基因沉默的假说认为，PTGS包括3个阶段：起始、维持和信号放大与传播。二、VIGS的原理•双链RNA(dsRNA)是基因沉默的起始因子.•第一阶段包括dsRNA形成、识别和小干扰RNA(siRNAs)片段的产生,由RNA病毒复制机制、源于转基因的双向克隆形成的发夹RNA(hpRNA)和反义RNA(asRNA)克隆技术均可产生dsRNA;dsRNA被识别并被Dicer酶从两端降解成21～23核苷酸的siRNA。二、VIGS的原理•在维持期，siRNA与RNA酶形成复合体即RNA诱导沉默复合体(RISC)，后者具有RNA同源性寻找活性和解旋酶活性以解旋dsRNA，该复合物可被解旋的siRNA激活,鉴别单链siRNA序列和降解互补的转录产物。二、VIGS的原理•在第三阶段，上述形成的siRNA作为信号被鉴别，在RdRp(RNA依赖RNA聚合酶)引导下，siRNA作为dsRNA扩增的诱发子并以ssRNA(单链RNA)作模板，将沉默反应放大、增强，在这个过程中，siRNA可能作为一种信号分子在植株中系统传播，诱导更多细胞启动PTGS，进一步放大了PTGS效应。原理图示图1VIGS原理图注:dsRNA:双链RNA;Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ(Ribonuclease,ⅢRNase)Ⅲ家族的成员;siRNA:小干扰RNA;RISC:RNA诱导沉默复合体三、VIGS的优缺点优点：•首先，在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下即可进行VIGS分析。•其次，VIGS操作简便，能快速获取表型。•第三，VIGS无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获取非常困难的植物种类来说至关重要。三、VIGS的优缺点•第四，VIGS可用于突变致死的基因功能研究。•第五，VIGS可用于功能冗余基因的功能研究。•第六，VIGS可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究。三、VIGS的优缺点缺陷：虽然VIGS技术短短几年中取得较大的发展，但此种技术目前仍然存在一定的缺陷。•首先，VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以致VIGS技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此种技术自身最大的局限性。•其次，如何获得目标基因的系统性沉默仍然是VIGS技术目前需要解决的问题。三、VIGS的优缺点•第三，沉默持续的时间问题。•第四，目前最稳定和最有效的VIGS载体都有一定的宿主范围限制，其中绝大部分都只是在烟草和茄科植物(如番茄)中应用。•第五，病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较强的沉默效果，是VIGS技术实验操作中的关键性步骤。四、VIGS技术的应用第一个VIGS载体是由模式RNA病毒烟草花叶病毒(TMV)发展的。1995年Kumagai等在TMV上插入了一段PDS基因的部分序列，侵染本氏烟后成功地诱导了PDS基因的沉默。PDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光漂白症状。PDS表型变异易于辨别，因此PDS基因成为VIGS体系评价的参照基因。四、VIGS技术的应用由于VIGS的有效性和快速性，近些年将一些VIGS体系的载体进行改良，在特定的寄主植物上赋予新的功能，并且成功地用于解析许多具有重要意义的植物基因功能。其中，应用最多的就是基于TRV烟草脆裂病毒TobaccoRattleVirus）的VIGS体系，并广泛用于验证重要经济作物的多基因沉默。VIGS与小麦•在单子叶植物中可利用的载体是大麦条纹花叶病毒(Barleystripemosaicvirus,BSMV)改造的VIGS载体,并在大麦上实现了八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因的沉默。•Hein以BSMV改造的病毒载体在大麦上验证了Mla13介导的抗白粉性。Scofield利用大麦的一段PDS基因在小麦中实现了基因沉默。VIGS...