PCR污染及解决对策VIP免费

1 PCR 污染及解决对策 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA 或 RNA 片段的方法，在微生物感染的诊断中具有重要的价值。在 PCR 扩增过程中，扩增的 DNA 产量是呈指数上升的，经过 n 个循环的扩增，一个 DNA 分子的产量便达到 2n 个拷贝。PCR 产物一般为 1013 拷贝/ml，取 0.1ml 即为 109 拷贝，而 1mg 人基因组 DNA 才含 1.4´106 拷贝的单拷贝基因片段，因此使得 PCR 扩增反应具有强大的扩增能力，提高了检测的敏感性。此外，利用 PCR 反应，还能够对感染因子实施定量分析，实时监测其在宿主体内的动态变化，有利于指导临床诊疗。正是由于 PCR 反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染便可导致假阳性结果。PCR 反应中，主要存在三个污染源：1.标本间的交叉污染；2.实验室克隆质粒的污染；3.PCR 扩增产物的污染。其中以第三个污染源最主要，通过下面一个例子便可认识到 PCR 产物污染的严重性。在 100ml 的反应管中可产生 1012 拷贝个分子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池（50m´25 m ´2m）内稀释后，0.1 ml 稀释液含有 400 拷贝的扩增分子，远远超过了 PCR 扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，PCR 检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。本文就PCR 污染的预防、污染源的追踪及污染的处理进行分析。 一． 污染的预防 进行 PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。 （一）划分操作区 目前，普通PCR 尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行： 1. 标本处理区，包括扩增摸板的制备； 2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增； 3. 产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→ PCR 扩增→ 产物分析→ 产物处理。 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。 （二）分装试剂 PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的 DNA： 1． PCR 用水应为高压的双蒸水； ...