RNA抽提与反转录步骤xVIP免费

1 / 8 RNA 抽提步骤 准备： DEPC 水配制：1000ml 双蒸水中加1mlDEPC，充分振荡使其溶解，放在1000ml 容量瓶中静置过夜后备用。配成终浓度为0.1%，室温搅拌过夜，121℃高压20min，4℃密封保存。注：DEPC 属于一种致癌物质，易挥发，要小心并在通风橱中操作，高压后就会分解，其毒力消失。(用来泡器械的不高压，用来配置试剂的话要高压) 灭菌： 匀浆器、手术器材（剪刀、镊子）铝箔包好，EP 管、枪头（三种规格）、铝箔、纸 121℃ 60 （120min）min；DEPC 水 80℃ 30min。其中手术器材用于提取组织RNA。（匀浆器180°，120min） 1. 加Trizon 裂解细胞：加入适当量的Trizol 至细胞中（直接加入去培养液平板中后用枪吸出，亦可细胞刮下后离心去上清再加，用量约1ml Trizol 每3×106、cells）。贴壁细胞在遗弃培养基后，可以直接加入 Trizol（按10cm2 / 1ml Trizol 的比例）裂解，匀浆一定要彻底。反复吹打以打碎 细胞结 块 ，室温放置5min，使其充分裂解。（注：此 时 可以-80℃长期 保存） 2. 4 度，12000g×5min 离心弃沉 淀 。 萃 取除 杂 蛋 白 ：加入 0.2 体 积 的氯 仿 ，立 即 剧 烈 摇 动 充分混 匀。混 匀后冰 上放置15min。(注：禁 用漩 涡 震 荡器，以免 基因 组DNA 断 裂，造 成基因 组DNA 污 染 ) 3. 4℃，12000g，离心15min，此 时 溶液分为三层 ：下层 的酚 -氯 仿 ，白 色 浑 浊 的中间 相 多为变 性 蛋 白 ，水相 （R N A 所 在相 ），小心吸取水相 （宁 可损 失，也 不要吸到 中间 相 ），转 移 至另 一干 净 RNaseFree EP 管中；一般 水相 的体 积 为Trizol 的60℅. 异 丙 醇 沉 淀 ：向 水相 中加入 0.5 倍 体 积 （相 对 于Trizol）的异 丙 醇 ，充分混 匀，混 匀后置于-20℃1~2h 或 -80℃30min，4℃，12000g，离心5-10min；（经 过此 步可在管底看 到 白 色RNA 沉 淀 ）；如 果 起 始 量大 的话，可以加入异 丙 醇 即 可观 察 到 微 量浑 浊 ，则 可直接离心。弃上清，RNA 沉 于管底。移 去上清。 4. 75%乙 醇 （DEPC 水配制）漂 洗 ：加入 0.5-1ml 75%乙 醇 （让 75%乙 醇 从 沉 淀 上缓 缓 流 过，温和 震 荡离心管，悬 浮 沉 淀 ，7500g 5min（转 速 太 大 可能 会使RNA 断 裂）吸去乙 醇 ，然 后用枪吸...