分子杂交 1 分子杂交的概念及基本原理 主要内容：一、分子杂交的概念 二、分子杂交基本原理 （一）DNA变性： 1、DNA变性的方法 2、增色效应 3、溶解曲线 4、融解温度 5、影响 Tm值的因素。 （二）复性：退火 一、分子杂交的概念： 分子杂交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或 RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组 DNA分子中的同源基因或同源序列。 二、分子杂交基本原理： （一）DNA变性： DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。 1、DNA变性的方法： 1)加热； 2)改变 DNA溶液的pH； 3)有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。 2、增色效应：DNA在 260nm处有最大吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。在 DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。利用 DNA变性后波长 260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。 3、溶解曲线：如果升高温度使 DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。 4、融解温度：通常人们把 50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对分子杂交 2 应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature， Tm）。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。 5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关： 1) 外部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。 2) 内部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性；在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。 6、DNA中的GC含量与Tm值关系： Tm = 69。3 0。41 × % （G C） 对于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（G C） 2（A T） 实验表明 DNA分子中（G C）克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系。 （二）复性：变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。 退火：通常DNA热变性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低 25～30℃左右时，变性...
