藻类生长抑制实验四、实验步骤三、实验材料与方法二、实验原理一、实验目的与内容主要内容五、实验结果六、注意事项七、讨论与思考实验目的与内容一、实验目的1.了解藻类的生长规律；2.掌握藻类的培养方法；3.掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的评价方法。二、实验内容1.运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污染物的水环境中的生长抑制情况；2.求出受试化合物对藻类生长抑制的EC50；3.阐明受试化合物的剂量－效应关系与生长抑制特征。单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。因为可在短期内获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影响，所以利用污染物对藻类生长的抑制作用，能反映污染物水平对水体中的初级生产者的作用情况。通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在规定的实验条件下继续培养，每隔24h测定藻类种群的浓度或生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。经方差分析或t检验，显著低于对照(P<0.05)的生长率表明藻类生长受到抑制。实验原理实验仪器与试剂1.受试物研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定性好且可溶于水的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能超过0.1mL/L。2.藻种斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)或蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)。3.培养基藻类的培养基很多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻可用“水生4号”培养基培养。配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸馏水或去离子水中。应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解后再加另一种。亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌后避光冷藏保存。当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。表1水生4号小球藻和栅藻培养基营养盐含量(mg)营养盐含量(mL)(NH4)2SO40.200FeCl3(1%)0.015Ca(H2PO4)2∙H2O0.030土壤浸出液*0.500NaHCO30.100水1000KCl0.025MgSO4∙7H2O0.080*取少量菜园土，加2–3倍自来水，煮沸10余分钟，冷却后用滤纸过滤即可使用。4.实验器材电子天平(2台)、立式压力蒸汽灭菌器(2台)、无菌操作台(4台)、显微镜(4台)、生化培养箱(2台)、pH计(4套)、气浴恒温摇床(4台)、可见分光光度计(4台)、数字照度计(2台)、血球计(4套)、血小球记数板(200块)、4到7只30W的普通白色荧光灯、ф60漏斗(4个)、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。5.实验药品硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯化铁均为分析纯，土壤浸出液。实验步骤1.藻类培养培养温度为：24±2℃；白色荧光灯均匀光照，光照强度为4000±400lux，连续光照或以12：12或14：10光暗比光照；机械震荡(100±10次/min)；培养容器用棉塞、滤纸、纱布(2~3层)或锡箔纸等封闭，对挥发性化学物质采用磨口玻璃瓶塞完全封闭。可根据实验需要选择容量不同的实验容器，125mL锥形瓶中测试液的体积为40-60mL；250mL锥形瓶中测试液体积为70-100mL；500mL锥形瓶中测试液的体积为100-150mL。2.藻试液的配制从储备液中取出一定的藻液，接种到新鲜的无菌培养液中，接种浓度约为104个/mL。在与试验要求相同的条件下进行预培养，要求在2–3天内藻类能达到对数生长，然后再次转移到新鲜的培养液中。如此反复转接培养2–3次，藻类生长健壮并开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类试验液。3.受试物试验液的配制根据初步试验确定产生效应的浓度范围，至少设置五个构成对数间距系列的浓度，浓度比不超过2.2。最低测定的浓度必须对海藻生长没有影响。最高测定浓度必须抑制相对对照实验至少50%的绿藻生长，最好使绿藻生长完全停止。至少设置3个平行样，每一系列设一个对照。实验前应测定受试液的pH，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到7.5±0.2。试验结束时应测定被测物质的实际浓度。4.测试液的配制先在每个试验锥形瓶中加入50mL藻液，再加50mL受试物溶液。对照组只加50mL培养液。将各瓶摇动混匀后，放入光照培养箱中培养。实验开始后，每隔24h(即在24，48h)测定各组藻类的细胞密度。1.藻类生长的测定藻类生长是指在试验期间每毫升溶液中藻类细胞数目的增加量。一般用以下三种方法测定藻类的生长：①细胞计数；②测光密度；③测叶绿素...
