1 测序常见问题分析实例 峰型整齐，在某一点前后突然变乱 信号迅速衰减 信号极弱或无信号 整条序列信号杂乱 峰型整齐，在某一点前后突然变乱： 图1 Po ly T 特殊结构 上图是我们的一个质粒测序样品，用T7 通用引物进行测序，从图中可以看出，在约285bp的p o ly T 结构后，序列明显变乱。主要原因是在p o ly T 结构后，测序酶容易在模板上滑动，导致 p o ly T 结构后的峰型变得杂乱。此类样品通过对其反向互补序列进行测序，一般可以得到好的结果。 图2 移码突变双模板的存在 上图是我们的一个质粒测序样品，用M13+通用引物进行测序，从图中可以看出，该序列在290bp 后序列明显有两套峰存在。造成该现象的原因可能有如下几条： 序列发生缺失突变 2 插入外援片段的载体和未插入外援片段的载体同时存在 PCR 产物用T 载体进行克隆时，PCR 片段可以以两个方向克隆进T 载体 所挑克隆不纯 两个大小相近的PCR 产物同时存在，无法纯化分开 解决的办法： 对于质粒模板，重新挑选克隆，或从另一段进行测序 对于PCR 模板，用另一端引物进行测序，或克隆后进行测序 图3 等位基因双模板的存在 上图是针对一个质粒进行的测序结果，从图中可以明显看出，在序列的80bp到120bp之间有两套峰存在，但是没有发生移码突变。该情况与图2 所举的例子有所不同，该情况下从反向进行测序仍然不可能得到好的测序结果。该种情况下只能采取克隆的方法将两套模板分开，分别进行测序。 信号迅速衰减 返回 图4 CTT 重复结构 如上图，在大约 260 碱基后出现了一个严重的CTT 重复结构，导致信号迅速衰减，很难得到跨过该区后的信息。该种情况下，只能从另一端进行测序，一般来说，AAG 重复结构不会太影响测序。也可以对片段进行亚克隆，使每个片段大小不大于200bp，然后再进行测序。不过，该方法要麻烦很多。 3 图5 GGT重复结构严重影响测序 上图下半部分是一个质粒模板用M13+通用引物进行测序，大约在130bp开始，出现GGT重复结构，测序信号迅速减弱至消失。上图的上半部分是用M13-通用引物从反向进行测序，在反向序列上该重复是GGT 的反向互补序列，即 ACC，大约在500bp处，测序很轻松地就读过了 ACC 重复序列区。GGT 重复结构严重影响测序的原因是在测序试剂盒中，为了得到均匀的测序峰型图，G 和 T 碱基均进行了替代，分别替代成 I 和 U，因此与模板的结合能力减弱，测序酶反应到此后就比较难延伸下去，...
