SouthernBlot实验流程(包括原理细节)VIP免费

Sou thern Blot 实验流程（包括原理/细节） 一、DNA 的提取 人和哺乳动物细胞基因组DNA 的分离通常是在有EDTA、Sarkos y e 等一类去污剂存在下，用蛋白酶K 消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNas e 处理和纯化来提取DNA。 (1)取单层细胞，经无钙、镁PBS 洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS 洗2次,弃上清，取细胞沉淀。 (2)加入2ml 细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkos y e 终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。 (3)50℃水浴 2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止 DNA 断裂，约 3min。 12000r/min 离心 15 分钟（室温） (4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质 12000 r/min 离心 15 分钟（室温） (5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次 (6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀 12000 r/min 离心 15 分钟（室温） (7)取水相，加入2 倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置 1 小时 12000 r/min 离心 15 分钟（室温） (8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥 10 分钟。 (9)加入RNas e A 至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1 小时，消化污染的RNA。 (10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkos y e 至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴 2 小时，加入NaAC 至终浓度10mmol/L。 (11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。 (12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。 (13)取水相，加入2 倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1 小时。 (14)取沉淀用 70%乙醇洗一次，真空干燥 10 分钟后溶于少量 TE 中，4℃贮存。 Sou thern 对 DNA 的质量要求比较高，一般来说，高质量 DNA 样品需具备以下几点： ① DNA 完整性好； ② DNA 纯度高； ③ 勿用 TE 溶解 DNA； ④ DNA 浓度不低于 0.7ug/ul，杂交需模板 DNA 约 20u g/泳道/次 二、引物设计 三、DNA 检测 1、DNA 浓度的测定 DNA 浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长 260nm 处，蛋白质则位于 280nm，分别测定后，其 OD260/OD280 的比值应大于 1.8.低于此值，说明 DNA 中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于 1.9 表明 DNA 链破坏，断裂严重，已...