基因表达载体构建基因工程（基因工程（22））1、基因工程操作步骤：.（1）获取目的基因的方法有.（2）是关键步骤，基因表达载体的组成：.一、自主导学：获取目的基因、制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与表达通过基因文库获取、PCR技术扩增、人工合成（反转录法和化学方法合成），真核生物常用人工合成方法。基因表达载体的构建目的基因、启动子、终止子和标记基因等（3）将目的基因导入受体细胞：基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。动物常把细胞作为受体细胞。导入植物细胞的方法有等；农杆菌转化法可以将目的基因导入细胞并把其整合到受体细胞的上，导入动物细胞的方法有；如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用处理，以增大细菌的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。受精卵农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法染色体DNA显微注射法CaCl2细胞壁细菌繁殖的速度非常快（4）、检测目的基因是否进入受体细胞可以用方法，用方法检测目的基因是否转录，用免疫（）法检测目的基因是否表达。另外也可进行个体水平检测。如4、基因拼接成功的原因；转基因表达成功的原因是生物。基因工程的意义：。DNA分子杂交DNA与RNA杂交抗原抗体反应让虫子啃食棉叶，观察虫子的存活状态。DNA都是双螺旋结构，基本组成单位都是脱氧核苷酸且遵循碱基互不配对原则共用一套遗传密码目的性强；克服远源杂交不亲和的障碍。实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：实例：利用大肠杆菌生产人的胰岛素简要过程：人(人胰岛素)大肠杆菌(无胰岛素基因）人的胰岛素基因与载体（DNA)结合导入大肠杆菌细胞获取分离发酵培养(含胰岛素基因)胰岛素（抗性检测与鉴定）Insulin（Levemir®）诺和诺德公司研制glargine（Lantus®）安万特公司研制胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，1000Kg胰腺只能提取40-50g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。能否用大肠杆菌生产人的胰岛素？如果能，如何实现？二、理解二、理解目的基因2、如何获取人的胰岛素基因（目的基因）？1、为什么要构建基因表达载体？如何使人的胰岛素基因（目的基因）与大肠杆菌质粒连接起来构建基因表达载体？3、如何针对基因表达载体进行加工和改造才能实现目的基因的稳定存在和高效表达？基因表达载体的构建是关键步骤，请思考：(1)如果目的基因的序列是已知的，可用化学方法合成目的基因，或者用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。(2)如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以从基因文库中获取。1、获取目的基因途径供体细胞中的DNA中直接分离基因人工合成基因（真核细胞）方法根据已知氨基酸序列合成DNA过程供体细胞中的DNA↓限制酶许多DNA片段↓载入运载体↓导入受体细胞↓外源DNA扩增,产生特定性状↓分离目的基因目的基因mRNA↓反转录单链DNA↓合成双链DNA(即目的基因)蛋白质的氨基酸序列↓推测mRNA的核苷酸序列↓推测结构基因的核苷酸序列↓化学合成目的基因优点操作简单专一性强专一性强，可产生自然界不存在的新基因。缺点工作量大，盲目性大，专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高。适用范围狭小鸟枪法反转录法编码区非编码区非编码区（能编码蛋白质）启动子终止子外显子内含子编码蛋白质（不能编码蛋白质）真核生物基因结构真核细胞与原核细胞在基因结构上有何异同？补充知识：基因的剪刀——限制性核酸内切酶（分子手术刀）一种酶识别并切割一种特定的核苷酸序列GAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCG黏性末端限制性内切酶限制性内切酶（1）利用限制酶和DNA连接酶如何构建基因表达载体？2、构建基因表达载体①单酶切-------先用同一种限制酶目的基因和质粒，再加入DNA连接酶质粒质粒目的基因目的基因②单酶切变双酶切（用两种酶分别切割目的基因的两端和质粒）为了防止目的基因和质粒在酶切后末端发生任意连接，酶切时应选用两种酶切割，从而保证目的基因和载体定向连接。（2...
