Westernblot实验原理和实验步骤VIP免费

Westernblotting基本原理和实验步骤为什么要做蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。目录1Westernblot基本原理2蛋白免疫印迹的组成3Westernblot一般流程4Westernblot常见问题分析1WesternBlot基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如PVDF膜上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。2组成蛋白免疫印迹（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步:是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步：把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，电转移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式两种。第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。3Westernblot流程图WesternBlot一般流程1蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交洗膜二抗杂交洗膜底物显色蛋白样品的制备21、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ulPBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ulPBS再加入5ul5Xloadingbuffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。2、分泌蛋白的提取：取15ul细胞上清，加入5ul5Xloadingbuffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳4分离胶浓度与蛋白分离范围5制胶1）装好架子，固定好玻璃板。2）注水试漏。3）倒水，甩干，用滤纸吸净残留水份。4)按照下面配方配制12%分离胶。一般1.5玻璃板需胶6.5-7ml，1.0玻璃板需胶4.5ml。5)将胶慢慢倒入，防止有气泡产生。6）在胶上面加入一层蒸馏水，可以将胶里的气泡压出、将胶面压平并防止顶层胶风干。7)待分离胶凝集后（至少20度，30min），配制浓缩胶5％。6制胶过程注意事项操作时要使两玻璃对其，以免漏胶加完分离胶后，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。插梳子时要使梳子保持水平。7上样与电泳将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。浓缩胶用70V电压，当样品至分离胶时，用120V电压，至溴酚兰跑到底时停止电泳。电泳时常遇到的问题︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。8转膜在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用...