实验、双向琼脂扩散试实验、双向琼脂扩散试验验实验、双向琼脂扩散试实验、双向琼脂扩散试验验实验目的：•了解双向琼脂扩散的原理和用途。•掌握抗体效价的测定方法。•观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应。实验原理将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。双向琼脂扩散试验•一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带•根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原的组成。免疫学及免疫学检验A：Ag、Ab浓度及扩散率近似；B：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab浓度近似，扩散率Ag＜Ab；D：扩散率近似，浓度Ag＞Ab；E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab；F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab沉淀线形状、位置与抗原抗体扩散率及浓度的关系免疫学及免疫学检验(1)沉淀线吻合：待检抗原与标准抗原完全相同。(2)沉淀线相切：待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。(3)沉淀线相交：待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。(4)沉淀线部分吻合：待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。A1：待检抗原；A2：标准抗原抗体效价滴定用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。免疫学及免疫学检验•材料与试剂•1．琼脂粉•2．微量加样器、打孔器、载玻片、湿盒、温箱•3.抗原健康人血清，用生理盐水做1:5-1:40系列倍比稀释•5.抗体羊抗人IgG抗血清•操作方法1．称取一定量的琼脂粉，按1.5%（10-15g/L）的比例加入生理盐水，煮沸融化。2．取一张洁净干燥的载玻片，置于水平台上，用吸管取充分混匀的抗体琼脂液4ml浇于载玻片上，置于室温冷却凝固。制板要求布满整张玻片，切均匀平整，厚薄一致无气泡。3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径3－5mm）打成梅花形孔图。4．可用注射器针头挑出孔中琼脂。孔要求打得圆而光滑，边缘不能有破裂。5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。6．吸取样品加入孔内(约10ul)，以加满为度。中心孔加入抗体，周围孔分别加入不同稀释度的抗原。7．扩散将加样的琼脂凝胶板放在湿盒内，置于37度，24h后观察结果。若沉淀环不清晰可用1%的鞣酸浸泡10min。•结果判定．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。1.双扩散用于疾病诊断：以IBD（炎性肠病）诊断为例，中心孔加IBD标准阳性血清，周围孔分别加IBD标准抗原、生理盐水、待检抗原1.2.3.4。2.双扩散用于抗体检测：以免疫鸡IBD抗体检测为例，中心孔加IBD标准抗原，周围孔分别加IBD标准阳性血清.、IBD阴性血清、待检血清1.2.3.4。1.双扩散用于疾病诊断：以IBD（炎性肠病）诊断为例，中心孔加IBD标准阳性血清，周围孔分别加IBD标准抗原、生理盐水、待检抗原1.2.3.4。2.双扩散用于抗体检测：以免疫鸡IBD抗体检测为例，中心孔加IBD标准抗原，周围孔分别加IBD标准阳性血清.、IBD阴性血清、待检血清1.2.3.4。•双向免疫扩散的影响因素：•1抗原、抗体因素•1.1抗原、抗体的水溶解性•1.2抗原的决定簇数量及分子量•1.3抗体的单一性•1.4抗原、抗体浓度和纯度•1.5抗原、抗体的反应比例•1.6抗原抗体反应的可逆性•2琼脂板因素•2.1琼脂的浓度、粘度•2.2pH值•2.3电介质•2.4孔间距...
