环 介 导 等 温 扩 增 （ LAMP） 引 物 设 计 LAMP 引 物 设 计 关 键 点 ： Tm 值 ， 引 物 末 端 稳 定 性 ，GC 含 量 ， 二 级 结 构 ，引 物 间 距 1.Tm 值 引 物Tm 值 采 用Nearest-Neighbor Method 进 行 预 测 ， 该 法 所 预 测 的 值可 能 是 最 为 接 近 真 实 情 况 。 通 常 情 况 下 ， Tm 值 会 受 实 验 条 件 所 影 响 ， 例 如 盐 浓度 、 寡 核 苷 酸 浓 度 等 ， 因 此 需 在 实 验 条 件 下 对 Tm 值 进 行 预 测 。 寡 核 苷 酸 0.1 μM； Na+ 50 mM； Mg2+ 4 mM； 各 个 引 物 的 最 终 Tm 值 需 尽 量 满 足 以 下 条 件 ： F1c/B1c = 64-66 °C； F2/B2、 F3、 B3 = 59-61 °C； LoopF/LoopB = 64-66 °C； 2.引 物 末 端 稳 定 性 引 物 的 末 端 是DNA 复 制 的 起 点 ， 因 此 需 要 一 定 的 稳 定 性 。（ 通 常 情 况 下 ，引 物 需 要 一 个 稳 定 的 5’端 和一 个 相对 不稳 定 的 3’端 ， 自由能 绝对 值 越高， 则形成的 DNA 双链越稳 定 ， 即越容易退火。 ) F2/B2， F3/B3， LoopF/LoopB 的 3’末 端 自 由 能 ≤ -4 kcal/mol； F1c/B1c 的 5’末 端 自 由 能 ≤ -4 kcal/mol； 此 处 的 末 端 自 由 能 指 末 端 6 个 碱 基 的 自 由 能 。 3.GC 含量 引物的 GC 含量尽量在 40-65%。50-60%的 GC 含量可能 会有更好效果。 4.二级结构 需确保引物不会形成二级结构， 例如二聚体， 发卡结构。 5.引物间距 F2 的 5’末 端 到 B2 的 5’末 端 约为 120-160 bp； F2 的 5’末 端 到 F1c 的 5’末 端 约为 40-60 bp； F3 的 3’末 端 到 F2 的 5’末 端 约为 0-60 bp； 1.上传序列 打 开PrimerExplorer V4 网 站 ： http://primerexplorer.jp/elamp4.0. 0/index.html 上 传 所 选 的DNA 特 异 序 列 （ 序 列 长 度 需 小 于2000 bp）， 参 数 选 择Automatic Judgment， 然 后 点 击 Primer Design。系 统 自 动 对 所 上 传 的 序 列 进行 分 析 ： GC% ...
