fish荧光原位杂交VIP免费

荧光原位杂交荧光原位杂交FluorescenceinsituFluorescenceinsituhybridizationhybridization（（FISHFISH））荧光原位杂交（FluorescenceinsituhybridizationFISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。探针染色体特异重复序列探针；如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测。全染色体或染色体区域特异性探针；由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成特异性位置探针。由一个或几个克隆序列组成实验相关溶液的配置1）20×SSC：175.3gNaCl，88.2g柠檬酸钠，加水至1000mL（用10mol/LNaOH调pH至7.0）。2）2×SSC：40ml20×SSC+360mlH2O。3）0.2NHcl：0.5ml浓Hcl+29.5mlH20。4）10%中性福尔马林：4ml甲醛+36mlPBS。5）变性液（pH7.0）：24.5ml甲酰胺+10.5ml2×SSC。6）杂交后洗液：100ml2×SSC+0.3mlNP-40。7）70%、85%、100%乙醇，置于-20oC保存。8）DAPI溶液：用去离子水配制1mL/mgDAPI储存液，按体积比1:300，以antifade溶液稀释成工作液。（DAPI—4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料；antifade—抗荧光淬灭剂）实验方法和步骤标本前处理样品变性探针准备杂交杂交后洗涤衬染及封片一、标本前处理1.脱蜡：依次通过二甲苯15min×3次，无水乙醇10min×3次，室温风干。2.预处理：0.2NHcl处理20min蒸馏水3min2×SSC3min×2次，室温晾干预处理液80oC反应40min（预处理液需预热）蒸馏水1min3.蛋白酶处理：吸干组织周围液体后，加蛋白酶在37oC反应15min（蛋白酶需预热，片子需放在湿盒上滴加）4.后固定：10%中性福尔马林10min2×SSC5min×2次，室温风干。二、样品变性1.将变性液倒入染色缸中，水浴加热至72±1oC，片子放入前确认温度已达到72±1oC。（变性液倒入染色缸中水浴加热约需30min）2.放入波片至变性液中，继续72±1oC变性5min。3.取出波片至70%冷乙醇中浸泡1min。4.85%、100%冷乙醇各脱水1min。5.吸去多余的乙醇，置于40oC-50oC烤片机上2-5min或者室温风干。三、探针准备1.室温下让探针复温，降低探针的黏度，以便探针充分准确吸取。2.涡流混合。把内容物装入试管底部，每个试管用台式离心机离心2-3秒，然后再次轻轻涡流混合。四、杂交1.加10uL混合后的探针到载玻片的靶区，立刻在探针上加盖盖玻片，让探针均匀的在盖玻片下扩散。气泡会干扰杂交应该避免。探针使用后需要及时再冷冻保存。2.在盖玻片的周围注射少量的树胶于盖玻片和载玻片交界处重叠，在盖玻片和载玻片周围形成密封圈。3.将封好的片子放入37oC预热的杂交盒中盖紧盖子，孵育14-18h。五、杂交后洗涤1.从杂交盒中取出片子，用镊子轻轻拉掉密封胶。2.将片子放入预热过的杂交后缓冲洗液（2XSSC/0.3%NP-40）中，漂洗掉盖玻片。3.盖玻片小心被去掉后，吸干载玻片边缘过多液体，把载玻片浸入杂交后缓冲洗液中72±12min℃。4.从杂交后缓冲液中移出载玻片，把载玻片放在暗处竖立空气中干燥。六、衬染及封片1.加10uLDAPI复染载玻片靶区并加盖盖玻片。2.荧光显微镜观察或在暗处-20oC保存。荧光显微镜观察FISH结果FISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的位置，以HER-2DNAProbe来说，它会把HER-2基因部位橘红色荧光亮点，还将第17对染色体的中心颗粒（centromere）呈现绿色亮点，我们只要对比橘色和绿色亮点的数目，若橘色点/绿色点大于2，就表示有HER-2扩增，正常细胞橘色点/绿色点数目比值小于2。Her2基因高度表达正常Her2基因低度表达1+2+3+