在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色 。 双 重 免 疫 荧 光 标 记 法 (double immunofluorescence labeling method）也分为直接法和间接法。(1）直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗 B)以适当比例混合,滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。（2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞,洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属,且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配.免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下: 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育,孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察. 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。 5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对比。二、注意事项 1、荧光染色后一般在 1h 内完成观察，或于 4℃保存 4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退. 2、每次试验均需设置以下三种对比： (1) 阳性对比：阳性血清+荧光标记物; (2） 阴性对比：阴性血清+荧光标记物； （3) 荧光标记物对比：PBS+荧光标记物。三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是 donkey anti-rabbit-FITC(绿)和 donkey anti-rat—Tex—Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗 4℃孵育过夜比较好，背景比较清楚。 3、我的阳性对比采纳的是阳性组织切片,阴性对比则分别是家兔和大鼠的 IgG，荧光标记物对比是 PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用...
