酶的抑制剂与激活剂VIP免费

酶的抑制剂与激活剂授课教师:余子全研究生:贾亮何恋一.目的与内容目的：学习研究酶的抑制剂和激活剂的方法，并通过几种金属离子和表面活性剂对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响，筛选出该酶的某些抑制剂和激活剂。内容：1.几种金属离子Ca2+、Ag+、Cu2+、Hg2+和Mg2+对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响；2.洗衣粉对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响。二.基本原理酶分子与配体结合后，可以改变酶的活性。使酶活性降低乃至完全丧失活性的配体，称为酶的抑制剂；能启动和（或）增强酶的活性，称为酶的激活剂。研究酶的抑制和激活作用，具有重要的实用价值。抑制剂或激活剂的作用部位，主要是酶的活性中心的必要基团或直接影响酶的结构残基所引起的效应。本实验所用的是枯草杆菌碱性蛋白酶，该酶是由地衣芽孢杆菌经深层发酵提炼所得，能将大分子蛋白质水解成游离的氨基酸等产物，最适pH值一般为9-11，最适温度为40-50℃。Folin-酚法测碱性蛋白酶酶活原理Folin-酚试剂在碱性条件下，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。在一定浓度范围内，蓝色深浅与含酚羟基氨基酸(酪氨酸)的量成正比，通过比较加入金属离子(或洗衣粉)后和未加入金属离子(或洗衣粉)的反应酶液的OD680值，可以推断出该种金属离子是该酶的激活剂还是抑制剂。三.器材和用具1.恒温水浴锅，试管，722紫外可见分光光度计，移液枪，EP管，试管架。2.试剂：20mM/L氯化钙，20mM/L硝酸银，20mM/L硫酸铜，20mM/L氯化汞，20mM/L氯化镁，0.6％洗衣粉，0.4mol/L碳酸钠，2％酪蛋白，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(稀释2000倍)，福林-酚(市售福林-酚试剂加水稀释1倍，约为1mol/L)，0.5M/L氢氧化钠，pH10硼砂缓冲液，pH7磷酸缓冲液，10%TCA。四.操作步骤1．金属离子对酶活力的影响：(1)分别将1mlpH10.0酶液与相应体积的氯化钙、硝酸银、硫酸铜、氯化汞、氯化镁溶液混合，使反应液中金属离子终浓度分别为0.8mmol/L和0.4mmol/L。(2)混合液及pH10原酶液、pH10空白(共12支)25℃放置20min。(3)将混合液预热至40℃，加入预热的2%酪蛋白溶液1ml，于40℃反应10min。(4)反应结束时加入10%三氯醋酸溶液2ml(终止反应)，立即摇匀，静置10min。(5)各取上清1.5ml于EP管中，6000rpm,离心1min。取上清1ml于试管中，各加入0.4mol/LNa2CO3溶液5ml及福林一酚试剂1ml，置于40℃显色15min。(6)测定OD680值，并以原酶活力为100，算出相对酶活。空白试验时，先加三氯醋酸溶液，再加入酶液和底物，同样测定OD680值。2．洗衣粉对酶活力的影响：(1)分别在pH7.0和pH10.0酶液中加入洗衣粉(反应液终浓度为0.03%)。(2)混合液和pH7原酶液、pH7空白(共4支)于25℃下放置20min。(3)测酶活力，并以原酶活力为100，算出相对酶活。五.注意事项1.实验中，以先加TCA的酶液为空白，以原酶液试管为标准液，对其操作应与实验试管同步一致。2.由于分光光度计比较精密，所以往试管中加药品的时候要尽量做到准确。3.拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面；擦拭比色皿要顺着一个方向擦。4.在比色皿中装入的液体量大约是比色皿体积的三分之二。六.实验报告将实验结果填入下表中。表1金属离子对酶活力的影响金属离子剩余活力相对活力Ca2+0.8mmol/L1000.4mmol/L100Ag+0.8mmol/L1000.4mmol/L100Cu2+0.8mmol/L1000.4mmol/L100Hg2+0.8mmol/L1000.4mmol/L100Mg2+0.8mmol/L1000.4mmol/L100表2洗衣粉对酶活力的影响剩余酶活相对酶活标准pH7.0酶100pH10.0酶100洗衣粉pH7.0酶100pH10.0酶100八.问题与思考1.根据你的实验结果，上述实验因子哪些是枯草杆菌碱性蛋白酶的抑制剂，哪些是激活剂？2.用何方法可以解除或避免金属离子对酶的抑制作用？3.查阅文献，试对你的实验结果作出机理上的可能解释。