三代PCR技术原理及优劣VIP专享VIP免费

PCR技术20200221提纲•PCR之父介绍•第一代PCR仪•第二代PCR仪•第三代PCR仪及部分国产仪器前言生物学可以被划为两个时代：一个没有PCR，一个有PCR•凯利·穆利斯（KaryMullis）•1944.12.28—2019.08.07•大学：化学专业•博士：生物化学•选修天体物理，发表《Nature》•PCR技术诞生：1984年•1993年诺贝尔化学奖有人说：目前为止，诞生于生物领域的两大技术：1.PCR—核酸扩增技术2.CRISPR-cas—基因编辑技术第一代PCR技术——普通PCR技术原理图解技术应用能将微量的DNA大幅增加。因此对化石中的古生物残骸，犯罪现场的毛发、皮肤碎屑或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。技术优势PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。技术缺点1.最初的PCR技术所采用的核酸染料，会对实验人员和环境造成伤害2.PCR完成之后需要开盖检测，容易发生污染造成假阳性结果3.检测耗时长，操作麻烦，容易出错4.只能做定性检测第一代PCR技术就是最初的PCR，采用普通PCR扩增仪来对靶基因进行扩增，然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，只能做定性或半定量分析。第二代PCR技术——实时荧光定量PCR技术原理图解技术应用用于传染性疾病病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病诊断技术优点1.污染风险低2.操作流程更简单、经济高效3.需要的DNA和RNA加样量少技术缺点1.不同厂家生产的试剂和设备所产生的Cq值之间存在一定的差异，并不具备可比性2.存在背景值的影响，结果易产生偏差3.对于低拷贝的DNA往往难以检测4.当反应体系中有PCR抑制物存在时，常规的PCR体系经常会受到影响。第二代PCR就是实时荧光定量PCR技术（Real-TimePCR），也叫做qPCR,荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。通过荧光曲线来判断结果，并可以借助Cq值和标准曲线来实现相对定量。第三代PCR技术——数字PCR第三代PCR技术叫做数字PCR（DigitalPCR,dPCR,Dig-PCR）,这是目前全新的一种PCR检测方式，能对核酸进行检测和定量，采用直接计数目标分子而不依赖任何校准物或者外表，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。技术应用用于大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞。通过稀释样品DNA到对应的检测孔中，经过PCR扩增之后，向每个孔里加入特异性荧光探针与产物杂交，然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。主要应用于突变分析、等位基因缺失、混杂DNA的癌症检测等等。技术优点1.灵敏度更高数字PCR将传统的PCR反应分割成了数万个体系，这些体系独立扩增，独立检测，保证了个位数的模板数量都可以被检测到2.定量更准确数字PCR通过微体系的荧光计数，直接将反应初始模板数量统计出来，即使某些微滴中的模板数量不止一个，也可以通过泊松分布进行计算。3.抗干扰能力更强数字PCR第一步反应体系的分配过程中，会将模板和抑制物分配到不同的体系，降低抑制物的干扰。并且，与qPCR不同的是，dPCR检测的是终点荧光，即使微体系稍微受到了影响，也不会影响最终结果的判读。技术缺点1.模板质量要求较高由于数字PCR将反应拆分成了数万个独立体系，因此其对模板量有比较高的要求，模板量超过微体系量会导致无法定量，过少会导致信号过低，降低定量准确度。2.非特异性产物的判断数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光，无论PCR产物是否是特异性产物，只要荧光信号足够强，也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求极高。数字PCR—“微孔板”式数字PCR使用集成微流控芯片，芯片借助微流控阀门将注入的PCR混合液随机分散到反应室，小室之间通过“微流体阀”分隔20微升反应体系分散到20000个微孔中进行PCR反应，PCR反应结束后，采用CCD拍照统计阳性反应孔数字PCR——微液滴数字PCR（ddPCR）油包水反应体系，将20微升反应体系采用液滴反应器形成20000个液滴，利用流式细胞技术检测每一个液滴，统计阳性反应液滴数量原理与伯乐微液滴数字PCR相同，液滴形成能力强，理论上可以产生1000万个小液滴国内数字PCR厂商重庆泛生子生物科技有限公司广东顺德永诺生物...