电脑桌面
添加小米粒文库到电脑桌面
安装后可以在桌面快捷访问

三代PCR技术原理及优劣VIP免费

三代PCR技术原理及优劣_第1页
1/11
三代PCR技术原理及优劣_第2页
2/11
三代PCR技术原理及优劣_第3页
3/11
PCR技术20200221提纲•PCR之父介绍•第一代PCR仪•第二代PCR仪•第三代PCR仪及部分国产仪器前言生物学可以被划为两个时代:一个没有PCR,一个有PCR•凯利·穆利斯(KaryMullis)•1944.12.28—2019.08.07•大学:化学专业•博士:生物化学•选修天体物理,发表《Nature》•PCR技术诞生:1984年•1993年诺贝尔化学奖有人说:目前为止,诞生于生物领域的两大技术:1.PCR—核酸扩增技术2.CRISPR-cas—基因编辑技术第一代PCR技术——普通PCR技术原理图解技术应用能将微量的DNA大幅增加。因此对化石中的古生物残骸,犯罪现场的毛发、皮肤碎屑或血液,只要能分离出一丁点的DNA,就能用PCR加以放大,进行比对。技术优势PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制。技术缺点1.最初的PCR技术所采用的核酸染料,会对实验人员和环境造成伤害2.PCR完成之后需要开盖检测,容易发生污染造成假阳性结果3.检测耗时长,操作麻烦,容易出错4.只能做定性检测第一代PCR技术就是最初的PCR,采用普通PCR扩增仪来对靶基因进行扩增,然后采用琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析,只能做定性或半定量分析。第二代PCR技术——实时荧光定量PCR技术原理图解技术应用用于传染性疾病病原体检测,疾病耐药基因研究,药物疗效考核,遗传疾病诊断技术优点1.污染风险低2.操作流程更简单、经济高效3.需要的DNA和RNA加样量少技术缺点1.不同厂家生产的试剂和设备所产生的Cq值之间存在一定的差异,并不具备可比性2.存在背景值的影响,结果易产生偏差3.对于低拷贝的DNA往往难以检测4.当反应体系中有PCR抑制物存在时,常规的PCR体系经常会受到影响。第二代PCR就是实时荧光定量PCR技术(Real-TimePCR),也叫做qPCR,荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反映进程的荧光探针,通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。通过荧光曲线来判断结果,并可以借助Cq值和标准曲线来实现相对定量。第三代PCR技术——数字PCR第三代PCR技术叫做数字PCR(DigitalPCR,dPCR,Dig-PCR),这是目前全新的一种PCR检测方式,能对核酸进行检测和定量,采用直接计数目标分子而不依赖任何校准物或者外表,即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。技术应用用于大量正常细胞群中检测少数含突变的细胞。通过稀释样品DNA到对应的检测孔中,经过PCR扩增之后,向每个孔里加入特异性荧光探针与产物杂交,然后直接计数样本中突变型和野生型等位子的数量。主要应用于突变分析、等位基因缺失、混杂DNA的癌症检测等等。技术优点1.灵敏度更高数字PCR将传统的PCR反应分割成了数万个体系,这些体系独立扩增,独立检测,保证了个位数的模板数量都可以被检测到2.定量更准确数字PCR通过微体系的荧光计数,直接将反应初始模板数量统计出来,即使某些微滴中的模板数量不止一个,也可以通过泊松分布进行计算。3.抗干扰能力更强数字PCR第一步反应体系的分配过程中,会将模板和抑制物分配到不同的体系,降低抑制物的干扰。并且,与qPCR不同的是,dPCR检测的是终点荧光,即使微体系稍微受到了影响,也不会影响最终结果的判读。技术缺点1.模板质量要求较高由于数字PCR将反应拆分成了数万个独立体系,因此其对模板量有比较高的要求,模板量超过微体系量会导致无法定量,过少会导致信号过低,降低定量准确度。2.非特异性产物的判断数字PCR观测的是每个体系中的终点荧光,无论PCR产物是否是特异性产物,只要荧光信号足够强,也是会判读为阳性结果。因此dPCR的引物特异性要求极高。数字PCR—“微孔板”式数字PCR使用集成微流控芯片,芯片借助微流控阀门将注入的PCR混合液随机分散到反应室,小室之间通过“微流体阀”分隔20微升反应体系分散到20000个微孔中进行PCR反应,PCR反应结束后,采用CCD拍照统计阳性反应孔数字PCR——微液滴数字PCR(ddPCR)油包水反应体系,将20微升反应体系采用液滴反应器形成20000个液滴,利用流式细胞技术检测每一个液滴,统计阳性反应液滴数量原理与伯乐微液滴数字PCR相同,液滴形成能力强,理论上可以产生1000万个小液滴国内数字PCR厂商重庆泛生子生物科技有限公司广东顺德永诺生物...

1、当您付费下载文档后,您只拥有了使用权限,并不意味着购买了版权,文档只能用于自身使用,不得用于其他商业用途(如 [转卖]进行直接盈利或[编辑后售卖]进行间接盈利)。
2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。
3、如文档内容存在违规,或者侵犯商业秘密、侵犯著作权等,请点击“违规举报”。

碎片内容

三代PCR技术原理及优劣

您可能关注的文档

确认删除?
VIP
微信客服
  • 扫码咨询
会员Q群
  • 会员专属群点击这里加入QQ群
客服邮箱
回到顶部