实验抗菌药物敏感性试验目的要求1．掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结果的判读及其临床意义。2．掌握纸片扩散法的质量控制。器材和试剂1．菌种：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。2．培养基：水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）。3．试剂：无菌肉汤、0.5麦氏标准比浊管、抗菌药物纸片。4．其他：无菌棉拭、镊子、毫米尺、接种环。步骤和方法•（一）原理•（二）方法•（三）结果（一）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种检测菌的琼脂平板上。在纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内检测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对检测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC愈小。（二）方法•1.挑取孵育16～24h的血平板上数个菌落置于肉汤管中，校正浓度至0.5麦氏比浊标准。•2.用无菌棉拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后，在MH琼脂表面均匀涂布3次，每次旋转60°，最后沿平板内缘涂抹1周。•3.室温干燥3~5min后贴抗菌纸片，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。•4.平板室温放置15min后倒放于培养箱中培养。药敏纸片的选择待测菌药物金黄色葡萄球菌ATCC25923AMK、PEN、OXA、VAN、GEN、CIP大肠埃希菌ATCC25922AMK、FTX、GEN、PIP、CIP、IPM铜绿假单胞菌ATCC27853AMK、FTX、GEN、PIP、CIP、IPM（三）结果•1.结果判读：平板置黑色无反光背景上，测量抑菌环的直径。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环；磺胺药在抑菌环内会出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。（三）结果•2.结果解释：用毫米尺量取抑菌圈直径，参照标准判读结果。按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报告。•3.质量控制：标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内。如果超出该范围，应视为失控而不发报告，须及时查找原因，予以纠正。影响结果的因素•培养基•抗菌药物纸片•菌量•操作质量培养基•pH：7.2～7.4最适宜，碱性扩大氨基糖苷类药物的抑菌环，酸性扩大四环素类药物的抑菌环。•琼脂含量：影响抑菌环的大小。•厚度：影响抑菌环的大小，以4mm为宜。抗菌药物纸片•纸片含药量：与纸片的重量、吸水性、直径等有关，影响抑菌环的大小，批量制备。•纸片的保存：须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。只拿出少量放4℃备日常工作用。装纸片的容器从冰箱取出后，必须在室内温暖l0分钟以上才可打开。菌量•加大菌量：抑菌环减小。•减少菌量：抑菌环扩大。操作质量•平板使用时应放于35℃温箱30min，去除过多的水分。•接种细菌后应室温放置3~5min，待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。•培养温度：35℃为宜。•平板堆放：不宜超过两个，以使其受热均匀。•测量抑菌环：仔细、准确。
